1、.,1,重組人干擾素生產(chǎn)工藝,三組,.,2,主要內(nèi)容,干擾素概述 基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏（菌種） 干擾素的發(fā)酵工藝過程 干擾素的分離純化工藝過程,.,3,干擾素概述,干擾素的種類 干擾素的理化性質(zhì) 干擾素的生物學(xué)活性 干擾素的臨床應(yīng)用 干擾素的生產(chǎn)工藝路線,.,4,干擾素,概念： 干擾素是一種細(xì)胞因子，它是機(jī)體感染病毒時(shí)，宿主細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)，而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能相近的低分子糖蛋白。簡稱IFN。 發(fā)現(xiàn)： 干擾素是1957年英國科學(xué)家Isaccs等發(fā)現(xiàn)的。他們把滅活的流感病毒作用于小雞細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞產(chǎn)生了一種可溶性物質(zhì)，這種物質(zhì)能抑制流感病毒，并且能干擾其它病毒的繁殖

2、，因此，他們將這種物質(zhì)稱為“干擾素”。以后科學(xué)家們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，機(jī)體對入侵的異種核酸（包括病毒）都產(chǎn)生干擾素以進(jìn)行防御。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到病毒感染時(shí)，機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，干擾病毒復(fù)制，它是機(jī)體抗病毒感染的防御系統(tǒng)。,.,5,干擾素的理化性質(zhì),143-166aa； MW:18-40 ku； pI: 6.5-7.5； 乙醚、氯仿敏感 容易吸附玻璃、淀粉、醋酸 纖維膜、瓊脂和塑料等介質(zhì)。,.,6,型干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但這種效應(yīng)不是直接的，而是通過對宿主細(xì)胞的作用引起的。 對干擾素敏感的細(xì)胞表面存在干擾素受體，該細(xì)胞核內(nèi)有“抗病毒蛋白”基因，受干擾素

3、作用后該基因活化，產(chǎn)生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻譯，并促進(jìn)病毒mRNA降解。 干擾素能提高細(xì)胞表面MHC類分子的表達(dá)水平，受到病毒感染的細(xì)胞表面MHC類分子的增加有助于向Tc細(xì)胞遞呈抗原，引起靶細(xì)胞的溶解。 干擾素可增強(qiáng)NK細(xì)胞（自然殺傷免疫細(xì)胞）對病毒感染的殺傷能力。,干擾素的生物學(xué)活性,正常情況下組織或血清中不含干擾素，只有在某些特定因素的作用下才能誘使細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。,廣譜抗病毒活性機(jī)制,.,7,干擾素合成及作用,宿主細(xì)胞（白細(xì)胞）,.,8,抗腫瘤作用機(jī)制,型干擾素能抑制細(xì)胞的DNA合成，減慢細(xì)胞 的有絲分裂速度；這種抑制作用有明顯的選擇 性，對腫瘤細(xì)胞的作用比對正常細(xì)胞的作用強(qiáng)

4、5001000倍。另外，型干擾素也可通過增 強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)制、加強(qiáng)免疫監(jiān)督功能來實(shí)現(xiàn)其 抗腫瘤效應(yīng)。干擾素原始品種價(jià)格在10002000 多， 產(chǎn)量很低。運(yùn)用生物技術(shù)生產(chǎn)后的價(jià)格在4060之間，而且產(chǎn)量也很樂觀，運(yùn)用價(jià)值大大提升。,.,9,免疫調(diào)節(jié)活性機(jī)制,免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對宿主免疫細(xì)胞活性的影響，如對巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等均有一定作用。 對巨噬細(xì)胞的作用：IFN可使巨噬細(xì)胞表面MHC類分子的表達(dá)增加，增強(qiáng)其抗原遞呈能力；此外還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表面表達(dá)Fc受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體和腫瘤細(xì)胞。 對淋巴細(xì)胞的作用：干擾素對淋巴細(xì)胞的作用較為復(fù)雜，可受劑量和時(shí)間

5、等因素的影響而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或?qū)⒏蓴_素與抗原同時(shí)投入會(huì)產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產(chǎn)生免疫增強(qiáng)的效果。在適宜的條件下，IFN對B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用，但不能促進(jìn)其增殖。IFN能增強(qiáng)TH1細(xì)胞的活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能；但對TH2細(xì)胞的增殖有抑制作用，因此抑制體液免疫功能。IFN不僅抑制TH2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，而且抑制IL-4對B細(xì)胞的作用，特別是抑制B細(xì)胞生成IgE。 對其它細(xì)胞的作用：IFN對其他細(xì)胞也有廣泛影響：刺激中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力；活化NK細(xì)胞，增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用；使某些正常不表達(dá)MHC類分子的

6、細(xì)胞（如血管內(nèi)皮細(xì)胞、某些上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞）表達(dá)MHC類分子，發(fā)揮抗原遞呈作用；使靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對中性粒細(xì)胞的粘附能力更強(qiáng)，且可分化為高內(nèi)皮靜脈，吸引循環(huán)的淋巴細(xì)胞（增強(qiáng)免疫系統(tǒng)）。,.,10,重組干擾素的臨床應(yīng)用,廣譜抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。 直接抗腫瘤活性（rhuIFN） 毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 免疫調(diào)節(jié)活性治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFN） 多發(fā)性硬化癥 rhuIFN,.,11,干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）,體外誘生干擾素制備工藝： Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞 1989年：IFN-n3，批準(zhǔn)上市 產(chǎn)量

7、低：1g IFN，需要 3億ml人血白細(xì)胞 來源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴 潛在的血源性病毒污染的可能性,.,12,干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）,人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝： 1999年：IFN -n1, 批準(zhǔn)用于臨床。 優(yōu)點(diǎn)：首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。 缺點(diǎn)： 活性低，退出臨床應(yīng)用。,.,13,干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）,上市產(chǎn)品：rhuIFN -1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表達(dá)產(chǎn)物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工藝特點(diǎn)：分泌表達(dá)，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴(yán)格,動(dòng)物無限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：,.,14,干擾素生產(chǎn)工藝路線（

8、4）,上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表達(dá)產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體 工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程。,基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:,.,15,基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏,基因工程假單胞桿菌菌種建立 基因工程假單胞桿菌菌種特性 菌種庫的建立與保藏,.,16,基因工程假單胞桿菌菌種建立,第一步：干擾素-2b基因的克隆 第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建 第三步：工程菌的構(gòu)建,.,17,第

9、一步：干擾素基因的克隆(RT-PCR),制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR， 基因連接質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。 測序：編碼人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。,.,18,第二步：表達(dá)載體構(gòu)建, IFN基因與表達(dá)載體連接 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 篩選陽性克隆 獲得序列正確表達(dá)載體,.,19,第三步：工程菌構(gòu)建,轉(zhuǎn)化假單胞桿菌 篩選高表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的工程菌 獲得原始菌種,.,20,基因工程菌的特性,（1）具有宿主菌的特征： 細(xì)菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無芽孢，桿狀。 菌落：直徑2.5-3.0 mm，灰綠色半透明狀,粘稠。 （2）具有生產(chǎn)干擾素能力： 放

10、射性免疫學(xué)效價(jià)不低于2.0109 IU/L。,.,21,菌種庫的建立與保藏, QC（質(zhì)量控制）：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性 菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。,.,22,干擾素-2b的發(fā)酵工藝過程,.,23,搖瓶培養(yǎng),取保存工作種子批菌種，室溫融化 搖瓶培養(yǎng)：30，pH7.0，250 r/min，182h 檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。,.,24,種子罐培養(yǎng),接種：接入50L種子罐，接種量10%。 培養(yǎng)：30，pH7.0。 控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速 DO（溶解氧）為30%，34h，OD（吸光度）4.0。 檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。,.,25,LB培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基是一種培養(yǎng)

11、基的名稱,生化分子實(shí)驗(yàn)中一般用該培養(yǎng)基來預(yù)培養(yǎng)菌種,使菌種成倍擴(kuò)增,達(dá)到使用要求.培養(yǎng)的菌種一般是經(jīng)過改造的無法在外界環(huán)境單獨(dú)存活和擴(kuò)增的工程菌.通過培養(yǎng)工程菌,我們可以表達(dá)大量的外源蛋白,也可以拿到帶有外源基因的質(zhì)粒.這個(gè)名字來源於英語的lysogeny broth，即溶菌肉湯。（貝爾尼塔）,.,26,發(fā)酵罐培養(yǎng),接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。 控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。 前4h：30，pH7.0，DO為30%。 4h后：20，pH6.0，DO為60%，56.5h。 終點(diǎn)控制：OD值達(dá)9.01.0，5冷卻水快速降溫至15以下。 檢測：發(fā)酵液雜菌檢查,.,27,菌體收集

12、,連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000 r/min離心收集。 菌體保存：20冰柜，不超過12個(gè)月。 檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。,.,28,干擾素的分離純化工藝過程,干擾素分離工藝過程 干擾素的純化工藝過程,.,29,干擾素-2b分離工藝過程,菌體裂解 預(yù)處理 初級分離,.,30,(1)菌體裂解,裂解緩沖液：純化水配制，210（pH7.5） 使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF。 破碎20菌體：2厘米以下的碎塊 攪拌：加裂解緩沖液，210，2hr 凍融: 細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。,.,31,EDTA,本品為鈣離子絡(luò)合劑，洗滌劑，血液抗凝劑。生化研究中

13、用作鈣螯合劑，消除微量重金屬導(dǎo)致的酶催化反應(yīng)中的抑制作用。,PMSF,分離純化劑，有劇毒，使用時(shí)微量即可。,.,32,(2)預(yù)處理-沉淀,加絮凝劑聚乙烯亞胺: 210，攪拌45min，對菌體碎片進(jìn)行絮凝。 加凝聚劑醋酸鈣溶液: 210,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。,.,33,(3)離心,連續(xù)流離心機(jī)：210，16000 r/min 收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì) 雜質(zhì)沉淀：121、30min 蒸汽滅菌,焚燒處理。,.,34,（4）初級分離,鹽析: 4M硫酸銨，210，攪勻,靜置過夜。 離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干擾素，4保存。,.,35,

14、干擾素純化工藝過程,溶解粗干擾素 沉淀與疏水層析 陰離子交換層析與濃縮 陽離子交換層析與濃縮 凝膠過濾層析 無菌過濾分裝,.,36,(1) 溶解粗干擾素,配制純化緩沖液： 超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45 m濾器和10 ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至210。 檢查: 緩沖液的pH值和電導(dǎo)值。 溶解： 210，勻漿，完全溶解。,.,37,(2) 沉淀與疏水層析,等電點(diǎn)沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。 疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中 除非疏水性蛋白 洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。,.,38,等電點(diǎn)沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電

15、導(dǎo)值40 ms/cm，210，靜置過夜 超濾：1000 ku超濾膜過濾，除去大蛋白。 透析除鹽：調(diào)整溶液pH 8.0，電導(dǎo)值，10 ku超濾膜，0.005 M緩沖液。,.,39,(3)陰離子交換層析與濃縮,0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂。 鹽濃度線性梯度550 ms/cm進(jìn)行洗脫， 配合SDS-PAGE收集干擾素峰。 濃縮：調(diào)整溶液和電導(dǎo)，10 ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（pH5.0）中透析。,.,40,（4)陽離子交換層析與濃縮,用0.1M醋酸緩沖液（pH 5.0）平衡樹脂。 上樣，相同緩沖液沖洗。 鹽濃度線性梯度550 ms/cm進(jìn)行洗脫 配合SDS-PAGE收集干擾素峰。 濃縮：10