1、基因工程藥物的分離純化技術(shù),基因工程藥物的特點,目的產(chǎn)物在初始物料中含量低 含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜 目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差 種類繁多（多糖、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、疫苗等） 應(yīng)用面廣，對其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱源等,下游技術(shù),指從發(fā)酵液中分離和純化產(chǎn)品的技術(shù)過程，包括固液分離技術(shù)（離心、過濾、沉淀等）、細(xì)胞破壁技術(shù)（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶等）、蛋白質(zhì)純化技術(shù)（沉淀法、色譜分離法和超濾法等），最后還有產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)（真空干燥、冰凍干燥等），是運(yùn)用生物化學(xué)、物理學(xué)方法分離、純化產(chǎn)品，最終將產(chǎn)品推向市場并獲得社會或經(jīng)濟(jì)效益的過程。,基因工程產(chǎn)業(yè)化除上游構(gòu)建工程菌之

2、外,下游必須建立生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵工藝、離心、細(xì)胞破碎、目的產(chǎn)物的分離、純化、恢復(fù)表達(dá)產(chǎn)物的天然結(jié)構(gòu)使之具有生物活性、表達(dá)產(chǎn)物的修飾加工等。 就基因工程產(chǎn)業(yè)化而言,下游技術(shù)的研究與建立是十分重要的,又是十分耗時的,需要遠(yuǎn)比上游研究多得多的投資。,（一）、建立工藝需了解各種因素,含目的產(chǎn)物的初始物料的特點 物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì) 目的產(chǎn)物特性 產(chǎn)品質(zhì)量要求,與傳統(tǒng)方式相似,重組蛋白的分離純化也是利用其物理和化學(xué)性質(zhì)的差異,在進(jìn)行任何一種蛋白質(zhì)純化工藝設(shè)計之前,都需要盡可能多地先對提純的體系,目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行了解。如目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、等電點、疏水性、帶電性、碳?xì)滏溁蜃杂蓭€基存在情況等。另

3、外還需對影響目標(biāo)蛋白活性的因素有了解,如溫度、H、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑、重金屬離子、機(jī)械剪切力等,以保證純化后的蛋白活性。 當(dāng)前蛋白質(zhì)的純化主要是依靠色譜（層析技術(shù)）和電泳技術(shù)。由于重組蛋白在組織和細(xì)胞中仍以復(fù)雜混合物的形式存在,因此到目前為止還沒有一個單獨或一整套現(xiàn)成的方法把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來,而只能依據(jù)目標(biāo)蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)摸索和選擇一套綜合上述方法的適當(dāng)分離程序,以獲得較高純度的制品。,（二）、分離純化的基本過程,細(xì)胞破碎 固液分離 濃縮與初步純化 高度純化直至得到純品 成品加工,（三）、細(xì)胞的破碎方法,物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎法、高壓擠壓法 化學(xué)

4、破碎法：滲透沖擊、增溶法、脂溶法 生物破碎法：酶溶法,（四）、固液分離,沉淀：鹽沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、等電點沉淀、熱變性沉淀 離心：高速離心和超速離心 膜過濾：微濾、超濾和反滲透 雙水相萃取,（五）、重組蛋白質(zhì)的分離純化,分離純化主要依賴色譜層析分離方法。分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜及高壓液相色譜等 色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過程精制階段的常用手段，其優(yōu)點是該法具有多種多樣的分離機(jī)制、設(shè)備簡單、便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效應(yīng),2011-10-30,11,基因工程下游技術(shù),離子交換層析,離子交換層析(ion exchange chromatography

5、，IEC）是以蛋白質(zhì)分子凈電荷和表面電荷分布為分離基礎(chǔ)的。具體就是利用蛋白質(zhì)帶電性的差異,在離子吸附劑上靜電吸附能力不同,用不同的pH/離子強(qiáng)度洗脫液洗脫,從而使蛋白質(zhì)分離的柱層析方法。,離子交換色譜分辨率高、容量大、操作容易，為多肽、蛋白質(zhì)、核酸和許多發(fā)酵產(chǎn)物分離純化的一種重要方法 離子交換又分為：陽離子交換劑和陰離子,疏水層析,疏水層析(hydrophobic interaction chromatography，HIC）是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異，對蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離的層析方法 廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類大分子的分離以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和折疊機(jī)制的研究等,在高鹽濃度

6、時，蛋白質(zhì)與固定相疏水締合；鹽濃度降低時蛋白質(zhì)疏水作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來 疏水色譜回收率較高，蛋白質(zhì)與固定相的疏水作用力較弱，蛋白質(zhì)變性的可能性小，蛋白質(zhì)活性在層析分離過程中不易喪失,親和層析,親和層析(affinity chromatography，AC）是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間非常特異的生物親和力進(jìn)行吸附，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除,親和色譜是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生物大分子最為特異而有效的層析技術(shù)，分離過程簡單、快速，具有很高的分辨率，在生物分離中有廣泛的應(yīng)用。同時也可用于某些生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的研究,凝膠過濾層析,凝膠過濾層析(gel

7、 filtration chromatography）又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析，是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對溶液中各組分進(jìn)行分離的液相層析方法。填料有一定大小范圍的孔徑，大分子進(jìn)不去先洗脫，小分子進(jìn)入孔徑而后被阻滯，不同的蛋白質(zhì)根據(jù)它們大小和形狀的不同在層析柱中被分離,優(yōu)點：設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復(fù)性好、不改變樣品生物學(xué)活性等 缺點：分辨率較低，尤其是相對分子質(zhì)量相近的分子之間,廣泛用于蛋白質(zhì)(酶）、核酸、多糖等生物大分子的分離純化 用于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定、脫鹽、樣品濃縮等,（六）、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除,DNA的去除：離子交換層析、親和層析、疏水層析

8、熱原質(zhì)的去除：最好的方法是防止產(chǎn)生熱原質(zhì)，陰離子交換層析法，疏水層析法，親和層析法（多黏菌素B） 病毒的去除：色譜分離、紫外線照射和過濾,根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇 根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇,（七 ）、選擇分離純化方法的依據(jù),7.1 根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇,分泌型表達(dá)產(chǎn)物：濃縮處理（沉淀和超濾） 可溶性表達(dá)產(chǎn)物：親和層析，離子交換 周質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物：低濃度溶菌酶處理后，采用滲透壓休克的方法,包涵體：對蛋白質(zhì)分離純化有兩方面的影響，一是它可以很容易地與胞內(nèi)可溶性蛋白雜質(zhì)分離，蛋白純化較容易完成；另一方面產(chǎn)物經(jīng)過了一個變性復(fù)性過程，較易形成產(chǎn)物的錯誤折疊和聚合體,選擇不同機(jī)

9、制的分離單元組成一套分離純化工藝，盡早采用高效分離手段，將含量最多的雜質(zhì)先分離去除，將最昂貴、最費時的分離單元放在最后階段,7.2 根據(jù)分離單元之間的銜接選擇,先運(yùn)用非特異、低分辨的操作單元，如沉淀、超濾和吸附等，盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要的雜質(zhì) 隨后采用高分辨率的操作單元，如離子交換色譜和親和色譜 最后選用分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元如凝膠排阻色譜，可以提高分離效果,色譜分離次序的選擇,經(jīng)鹽析得到的液體不適宜于離子交換層析，可直接應(yīng)用疏水層析 離子交換色譜之后進(jìn)行疏水層析比較合適 親和層析多放在第二步以后 凝膠過濾色譜放在最后一步,要具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性 要盡可能減少

10、組成工藝的步驟 組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝與設(shè)備也能相互適應(yīng)，從而減少步驟之間對物料的處理和條件調(diào)整,7.3 根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇,在工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干擾產(chǎn)品質(zhì)量 工藝時間要盡可能短（生物活性收率會降低） 工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對設(shè)備要求低，能耗低 具有較高的安全性,（八）、產(chǎn)品的保存,目的產(chǎn)物失活受多種理化因素的影響，保存時要根據(jù)其不同特性，采取不同的措施，防止變性、降解，保護(hù)其活性 液態(tài)保存和固態(tài)保存,液態(tài)保存,低溫保存：液態(tài)蛋白質(zhì)樣品在-20-10以下冷凍保存 在穩(wěn)定pH條件下保存：蛋白質(zhì)較穩(wěn)定的pH一般在等電點附近 高濃度保存 加保護(hù)劑保存：糖類、脂肪類、蛋白質(zhì)類、多元醇及有機(jī)溶劑等,固態(tài)保存,固態(tài)蛋白質(zhì)比液態(tài)穩(wěn)