1、實驗4 細胞骨架的顯示及觀察姓名：李思露學(xué)號：一、 實驗?zāi)康?. 掌握用考馬斯亮藍R250染色觀察動物和植物細胞骨架的原理和方法。2. 了解免疫熒光法檢測細胞成分的原理和方法。二、 實驗原理1. 細胞骨架：指真核細胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系。廣義的細胞骨架包括細胞核骨架、細胞質(zhì)骨架、細胞膜骨架和細胞外基質(zhì)。狹義的細胞骨架是指細胞質(zhì)骨架，包括微管（microtubule，MT）、微絲（microfilament，MF）、中間纖維（intermediated filament，IF）。 2. 微管微管是細胞內(nèi)由微管蛋白形成的直徑約2026nm的長度不一的小管。分布在核周圍，呈放射狀向胞質(zhì)四周擴散，主要

2、確定膜性細胞器的位置和作為膜泡運輸?shù)膶?dǎo)管。微管蛋白有和 兩種。 異二聚體沿縱向聚合成絲，原絲成環(huán)狀排列形成微管的壁。微管不穩(wěn)定，對低溫（冷凍）、高壓等物理因素及秋水仙素（微管斷裂劑）等化學(xué)因素敏感。紫杉醇可以和微管蛋白多聚體結(jié)合，抑制微管解聚。3. 微絲：真核細胞內(nèi)是主要由肌動蛋白（actin）組成的直徑為57nm的骨架纖絲。主要分布在細胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)，作用是確定細胞表面特征、并與細胞運動、收縮、內(nèi)吞等功能有關(guān)。脊椎動物肌動蛋白分為、和三種類型，不同種類細胞中肌動蛋白組成不同。肌動蛋白單體為球形，依次連接成鏈，兩串肌動蛋白鏈互相纏繞扭曲成一股微絲。細胞松弛素B為微絲斷裂劑。4. 中間纖維：直徑介

3、于微絲和微管之間（711nm）、由多種不同蛋白組成的細胞骨架成分。在細胞中圍繞著細胞核分布，成束成網(wǎng)，并擴展到細胞質(zhì)膜，與質(zhì)膜骨架相連結(jié)。主要起機械支撐和加固作用。組成中間纖維的蛋白：角蛋白，波形蛋白，結(jié)蛋白、神經(jīng)纖維，神經(jīng)膠質(zhì)纖維和核纖層蛋白。不同組織來源的細胞，組成其中間纖維的蛋白質(zhì)種類可能不同。5. 研究細胞骨架的意義。（1）了解細胞骨架與細胞各種功能行使之間的關(guān)系。（2）了解理化因素是否通過影響細胞骨架對細胞功能產(chǎn)生影響，以便趨利避害。（3）鑒定發(fā)育中的細胞及腫瘤的來源。 6. 顯示細胞骨架的常用方法：考馬氏亮藍染色法、免疫熒光染色法、鬼筆環(huán)肽標記法。 （1）考馬斯亮藍染色法原理及特點

4、 原理：用去垢劑Triton X-100處理細胞適宜時間，可以溶解膜脂，并與大部分非骨架蛋白疏水區(qū)結(jié)合而將其溶解，剩下的纖維狀細胞骨架蛋白比較穩(wěn)定而不被溶解，然后用蛋白染料考馬斯亮藍染色即可顯示其結(jié)構(gòu)。特點：非特異蛋白染色，不能區(qū)分微管、微絲、中間纖維（2）免疫熒光染色法原理及特點原理：用TritonX-100處理固定處理過的細胞，可增加細胞膜通透性，使抗體能夠進入細胞內(nèi)與細胞骨架蛋白結(jié)合。接著用熒光素標記的抗骨架蛋白抗體便可通過直接免疫熒光法或間接免疫熒光法顯示骨架。特點：特異顯示各種骨架蛋白（3）鬼筆環(huán)肽標記法原理及特點原理：鬼筆環(huán)肽可特異性地結(jié)合肌動蛋白，因此，用熒光素標記的鬼筆環(huán)肽可以

5、顯示微絲。特點：靈敏，能特異顯示微絲。三、 實驗材料、試劑及用品（一） 材料： 洋蔥（二） 試劑（1）M-緩沖液。（2）6mM磷酸鹽緩沖液（pH6.8）。（3）含1%TritonX-100的M-緩沖液。（4）用M-緩沖液配制的3.0%戊二醛。（5）0.2%考馬斯亮藍R250染液。（6）0.9%氯化鈉生理鹽水。（三） 用品普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、水浴箱（ 37 ）小剪刀、鑷子、5mL一次性塑料注射器、膠頭吸管、1.5mLEP管、1.5mL試管架四、 實驗操作考馬斯亮藍染色法顯示洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞骨架（1） 材料準備：撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，裁成大小0.5cm.的小片。（2） PBS平衡：放入盛有

6、1mL 6mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）的EP管中，靜置使材料下沉（完全浸透）；然后用膠頭滴管吸棄液體。（3） TritonX-100處理：加1mL 1% TritonX-100溶液處理20min，然后用膠頭滴管吸棄液體。（4） 洗滌：用M-緩沖液洗滌3次，每次加1.5mL溶液浸泡5min，然后用膠頭滴管吸棄液體。（5） 固定：加1mL 3.0%戊二醛固定30min,然后用膠頭滴管吸棄液體。（6） 洗滌：用PBS洗滌3次，每次浸泡5min,然后用膠頭滴管吸棄液體。（7） 染色：用0.51.0mL 0.2%考馬斯藍R250染液染色10min。（8） 洗滌：用蒸餾水洗滌數(shù)遍。（9） 制備裝

7、片：給載玻片中央加1滴水，用鑷子夾取樣品在其中展開，然后加蓋玻片。（10） 顯微觀察：在普通光學(xué)顯微鏡下，洋蔥細胞骨架為布滿細胞的藍色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。（11） 對照樣品：省去步驟（3），不用TritonX-100處理；省去步驟（4）,用TritonX-100處理后不用M-緩沖液洗滌。五、 實驗結(jié)果及結(jié)論1.實驗樣品圖1洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞骨架（400倍）實驗樣品的細胞骨架分布細密均勻，視野中只剩下細胞骨架的蛋白質(zhì)，被考馬斯亮藍染成藍色。在視野的上半部分，細胞的背景呈現(xiàn)藍紫色，是由于最后洗滌不徹底所致。2.對照樣品：不用TritonX-100處理圖2不用TritonX-100處理的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞骨架

8、（400倍）不用TritonX-100處理的對照樣品的細胞中除了細胞骨架還有很多膜泡結(jié)構(gòu)，細胞中還有藍色的細胞核。不用TritonX-100處理，使得視野中有很多非骨架蛋白，這些非骨架蛋白被考馬斯亮藍染成藍色，影響對細胞骨架的觀察。3.對照樣品：用TritonX-100處理后不用M-緩沖液洗滌圖3用TritonX-100處理后不用M-緩沖液洗滌的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞骨架（400倍）圖3和圖2的情況類似，視野中沒有均勻細密的細胞骨架，這是由于M-緩沖液使細胞骨架中的微絲保持穩(wěn)定。在M緩沖液中，其中咪唑是緩沖劑，EGTA 和EDTA螯合鈣離子，溶液并提供鎂離子，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且

9、較為舒張，便于觀察。用TritonX-100處理后雖然可以溶解膜脂和非細胞骨架蛋白，但是保留下來的骨架蛋白在沒有M-緩沖液的作用下，其結(jié)構(gòu)仍無法保持穩(wěn)定，影響觀察結(jié)果。六、 作業(yè)與思考題1. 比較用與不用1%TritonX-100處理的實驗結(jié)果。答：見五、實驗結(jié)果與結(jié)論部分1、2。2 查閱資料說明M-緩沖液中咪唑、MgCl2、EGTA、EDTA、巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）在穩(wěn)定細胞骨架中的作用。 答：在M-緩沖液中，咪唑是緩沖劑，MgCl2提供Mg2+,EGTA 和EDTA螯合Ca2+，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于觀察；巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）可以在二硫鍵被打

10、開后使蛋白質(zhì)的四級或三級結(jié)構(gòu)被破壞，由于巰基乙醇能夠打開蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，它常常被用于蛋白質(zhì)分析，且?guī)€基乙醇也常常被用于保護蛋白質(zhì)中自由的半胱氨酸巰基之間不會錯誤形成二硫鍵。3. 設(shè)計檢測微絲的間接免疫熒光法實驗流程。（1） 用未標記的微絲抗體加到微絲抗原標本上，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。（2） 加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體，標記的抗球蛋白抗體和已結(jié)合抗原的抗體進一步結(jié)合。（3） 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：（-）無熒光；（）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（+）熒光明亮；（+ -+）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“+”以上，而各種對照顯示為（）或（-），即可判定為陽性七、反思與改進 1. 防止洋蔥鱗莖內(nèi)表皮卷曲、折疊，若卷曲折疊可以