1、流式細胞術(shù)樣品制備技術(shù)流式細胞術(shù)對細胞的分析檢測必須基于單細胞的基礎(chǔ)上，這是流式細胞術(shù)的基本要求。因此就必須把實體組織制備成單細胞懸液。在應(yīng)用FCM技術(shù)中，制備出合格的單分散細胞是流式細胞術(shù)樣本制備技術(shù)中重要的一環(huán)。它要求這種分散細胞方法既要使細胞成為單個細胞，又能保持細胞的固有生物化學(xué)成分及生物學(xué)特性。流式細胞術(shù)樣品制備大致可分為下面五個步驟： 取材：取手術(shù)或活檢組織必須具有代表性，如取手術(shù)腫瘤組織，必須取瘤細胞生長旺盛部位；組織等標本必須在取材后保持樣本的新鮮；一般在室溫1個小時之內(nèi)處理好樣本或及時用固定劑或低溫對組織進行保存； 對細胞的待測生物化學(xué)成分進行熒光染色； 按照廠家提供的軟件程

2、序?qū)颖具M行獲取、檢測和存儲； 再依照軟件提供的程序?qū)z測結(jié)果進行定量分析； 檢測分析結(jié)果在生物、醫(yī)學(xué)上的意義進行分析和評價。第1節(jié) 樣本單細胞懸液的制備方法一 新鮮實體組織樣本的制備FCM對單細胞快速進行各種參數(shù)分析必須基于單細胞基礎(chǔ)上，根據(jù)各種組織成分的特點，可選擇不同的分散細胞方法，以期達到單細胞產(chǎn)額高、損傷少的目的。盡管標本制備已形成了標準化的程序，但實際操作中總會出現(xiàn)這樣或那樣的問題。在實體組織分散為單個細胞過程中，解離的方法可能瞬間地或持久地影響細胞的性質(zhì)、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能等。所以，在對各種不同組織進行分散選擇方法時，應(yīng)盡量減少對細胞的這種影響。目前常用的分散組織細胞的方法有如下3

3、種。（一） 酶消化法1 作用原理：對實體組織分散的作用原理主要有3方面： 可以破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等； 可以水解組織間的粘多糖等物質(zhì)；可以水解組織細胞間的緊密聯(lián)結(jié)裝置的蛋白質(zhì)物質(zhì)。酶消化法是實體瘤、培養(yǎng)細胞分散為單細胞的主要方法之一。常用的酶類試劑有：蛋白酶類胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解離組織中的細胞。胰蛋白酶能水解脂鍵和肽鍵；膠原酶能降解幾種分子類型的膠原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷鍵；彈性蛋白酶能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖維。不同酶對細胞內(nèi)和細胞間不同組分有特異作用，可根據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類。2 注意事項： 酶需要溶解于適當(dāng)?shù)娜芤褐校?/p>

4、而這些溶液不致于造成酶效價降低；要注意酶的使用濃度和消化時間； 要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在堿性環(huán)境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶劑中活性不佳等； 要隨時注意影響酶活性的其它因素，如酶的生產(chǎn)批號等。3 方法學(xué)程序（1） 將適合于酶消化的組織置于離心管中；（2） 將選好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化組織的試管中；（3） 一般消化20-30分鐘（恒溫37或室溫），消化期間要間斷振蕩或吹打；（4） 終止消化，收集細胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細胞團塊，以低速成離心除去細胞碎片；（5） 將制備好的單細胞懸液進行進一步熒光染色后上機檢測，或保存?zhèn)溆?。（二?機械法機械法分散實體組織包括：用手

5、術(shù)剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織，用勻漿器勻漿，再用細注射針頭抽吸細胞或用300目尼龍網(wǎng)濾出單細胞懸液；采用搓網(wǎng)法也能獲得大量細胞。機械法易造成細胞碎片和細胞團塊，所以機械法常與其它方法配合使用。1 剪碎法： 將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水； 用剪刀將組織剪至勻漿狀； 加入10ml生理鹽水； 用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中； 離心沉淀1000prm,3-5min，再用生理鹽水洗3遍，每次以低速（500-800prm）短時離心沉淀去除細胞碎片； 以300目尼龍網(wǎng)濾去細胞團塊； 細胞用固定液固定或低溫保存?zhèn)溆谩? 網(wǎng)搓法 將100目，300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上； 把剪

6、碎的的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊加生理鹽水沖洗，直到將組織搓完； 收集細胞懸液，離心沉淀500-800prm，2分鐘； 固定細胞或低溫保存?zhèn)溆谩? 研磨法準備一只70ml研磨器。 先將組織剪成1-2mm3大小組織塊； 放入組織研磨器中加入1-2ml生理鹽水； 轉(zhuǎn)動研棒，研至勻漿； 加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器； 收集細胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀500-800 prm，1-2 min，再以生理鹽水洗3 遍，離心沉淀； 固定或低溫保存細胞懸液，備用。（三） 化學(xué)處理法1 作用原理化學(xué)處理法是將組織細胞間起粘著作用的鈣鎂離子置換出來，從而使細胞分散開來。2 試劑的

7、配制 0.2%EDTA配制：稱EDTA 0.2g，加入Hanks液100ml，封裝高壓消毒。置0-4保存； 胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g 加PBS（pH7.0）200ml，濃度0.125%，EDTA 0.2g加PBS（pH7.0）100ml，濃度0.2%。各取40ml混合，分裝置冰箱保存，用時過濾即可使用。3 實驗方法 將組織切成薄片，置入試管中； 首先加入EDTA液5ml，室溫下0.5h，離心棄之； 再加入胰酶-EDTA液5ml。在37恒溫水浴振蕩器內(nèi)30min； 用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀1000prm，5min。再以生理鹽水洗2-3次； 細胞固定或低溫保存?zhèn)溆谩Ｒ陨蠋追N分散細胞

8、的方法都是目前對實體組織解聚的常用的方法。實驗證明，用化學(xué)試劑方法處理組織導(dǎo)致細胞成活率低，細胞產(chǎn)額低，細胞碎片和細胞聚集的量不穩(wěn)定；化學(xué)試劑可單獨使用，也可與其它方法結(jié)合使用；機械法常常造成嚴重的細胞損傷，單細胞產(chǎn)量低；酶學(xué)法、化學(xué)法對實體組織的分散解聚較理想，但對所測化學(xué)成分有不良影響。所以要根據(jù)實驗?zāi)康娜ミx擇合適的單細胞懸液制備方法，才能獲得理想的樣本和更好的FCM檢測結(jié)果。（四） 注意事項 新鮮組織標本應(yīng)及時進行處理保存，以免組織在室溫下放置時間過長，產(chǎn)生中心組織壞死以及細胞自溶，影響FCM測定結(jié)果； 根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇最隹的固定方法，以免由于固定劑的原因，造成FCM檢測結(jié)果的不穩(wěn)定；

9、酶學(xué)法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時間、pH值、濃度等方面對酶消化法的影響。 需注意不同組織，選擇相應(yīng)的方法；如富于細胞的組織淋巴肉瘤、視神經(jīng)母細胞瘤、腦瘤、未分化瘤、髓樣癌以及一些軟組織肉瘤等，就不一定采用酶學(xué)法或化學(xué)法；往往用單純的機械法就可以獲得大量高質(zhì)量的單分散細胞； 在使用酶學(xué)方法時，要重視酶的選用，如含有大量結(jié)締組織的腫瘤食管癌、乳腺癌、皮膚癌等，選用膠原酶較好，因為膠原酶具有在Ca+、Mg+存在或在血清狀態(tài)下不發(fā)生活性降低的特性。二 組織活檢、內(nèi)窺鏡取材標本單細胞懸殊液的制備正常組織、瘤組織和淋巴結(jié)等活檢組織以及內(nèi)窺鏡（胃鏡、食管鏡等）取材標本，由于材料較少，

10、制備起來比較麻煩。但其制備方法與實體組織基本相似。1 取材后立即放入盛少許PBS液青霉素小瓶中；2 另取一只小燒杯，杯口用300目尼龍網(wǎng)蓋住并用線繩固定好，并用PBS液濕潤；取新鮮組織標本置尼龍網(wǎng)上；因標本量較少，尤其是內(nèi)窺鏡取材只少要取3塊以上；3 在操作前，先將剪刀用PBS液浸潤一下，然后開始剪碎組織；4 先剪幾下，視基本無組織塊存在時，用原來裝標本的青霉素小瓶中的PBS液，沖洗細胞均漿并過濾于小燒杯中；如果這時仍有可見組織塊，再用剪刀剪碎，再加適量該PBS液沖洗，直至網(wǎng)上無組織塊為止。這樣可盡量多的收集細胞；5 細胞加固定液或低溫保存，備用。三 石蠟包埋組織樣本的制備石蠟包埋組織單細胞分

11、散方法的建立，擴大了流式細胞術(shù)的應(yīng)用范圍。對大量臨床隨訪資料通過病理包埋組織的流式細胞術(shù)分析，可以重新得到深入研究和利用?，F(xiàn)將常用的石蠟包埋組織制備單細胞方法介紹如下。 1 實驗方法： 把石蠟包埋組織切成40-50um厚的組織片3-5片，或用乳缽研成0.5mm直徑大小顆粒狀，放入10ml的試管中； 加入二甲苯5-8ml, 在室溫下脫蠟1-2 天，視石蠟脫凈與否，更換1-2 次二甲苯，石蠟脫凈后，棄去二甲苯； 水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步為10 min，去乙醇，加入 蒸餾水3-5 ml，10 min 后棄之； 消化：加入2 ml 0.5% 胰蛋白酶（pH 1

12、.5-2.0）消化液，置37恒溫水浴中消化30 min， 在消化期間，每隔10min 用振蕩器振蕩1次； 消化30 min 后，立即加生理鹽水終止消化； 經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，未消化好的組織可做第2次消化； 收集細胞懸液，離心沉淀1500 prm ,再以生理鹽水漂洗1-2 次，離心沉淀500-800 prm 去 碎片； 保存細胞備用。2 注意事項 一定將石蠟從組織中脫干凈，一般脫蠟第1遍應(yīng)在12小時左右，第2遍為30min左右，檢測是否將石蠟已脫凈的方法:是棄去二甲苯，加入無水乙醇如果無絮狀物浮起，即可視為蠟已脫凈，反之則蠟尚未脫凈； 消化時間不可過長，以免造成已釋放出的細胞核被消化； 切片不

13、可過薄或過厚，過薄細胞碎片過多，影響分析結(jié)果；過厚造成脫蠟不理想。 消化后的組織應(yīng)先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min，37，然后用尖吸管吹打成懸液狀； 消化后的組織懸液經(jīng)過過濾后可能細胞數(shù)很少，這樣就要將組織片放在300目尼龍網(wǎng)上，用底部圓滑的試管磨碎，再用PBS液沖洗一下；如此反復(fù)，就能得到較多的單細胞懸液。四 外周血單個核細胞樣本的制備血液是天然的單個細胞分散的細胞懸液，血細胞在生理狀態(tài)下呈分散的游離狀態(tài)。它是流式細胞分析的理想樣品。血液中的主要細胞成分為白細胞、紅細胞和血小板；而其中白細胞主要成分又分為淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。但在血細胞中一般檢測單個核細胞較為多見。1

14、 外周血細胞樣本制備方法的選擇 一般檢測細胞大分子成分DNA、RNA、總蛋白質(zhì)、個別基因表達蛋白等，多采用淋巴細胞分離液分離法制備單個核細胞懸液。這樣可以從血液中分離出單個核細胞淋巴細胞、單核細胞、幼稚血細胞和腫瘤細胞等。外周血免疫細胞、細胞因子、某些基因蛋白、細胞表面標志檢測可采用溶紅細胞法。2 單個核細胞樣品制備程序： 取外周血2ml，肝素抗凝，用生理鹽水將血稀釋成4 ml ,混勻； 將稀釋后血液沿試管壁徐徐加入4ml淋巴細胞分離液到液面之上，勿用力過大，以免造成血液與分離液混合，保持清晰的分層狀態(tài)； 離心2000prm,30min,室溫18-20，離心后可見試管內(nèi)的血液清楚的分為4 層，

15、上層為血漿層，中層為分離液層（單個核細胞所處于血漿層和分離液層中間），底層為紅細胞層，紅細胞層上為粒細胞層； 用吸管將上層與中層之間的淋巴細胞層吸出收集到另1 試管中，用生理鹽水洗2 遍， 每次均以1500 prm ,10 min ,棄上清后即得到高純度的單個核細胞懸液； 用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭ɑ蛑玫蜏乇浔４娲?。?骨髓細胞單細胞懸液的制備1 制備方法（1） 無菌抽取骨髓液0.5 ml；（2） 將骨髓標本滴入1000u/ml肝素抗凝的1 ml PBS液中；（3） 再加入PBS液稀釋至10ml；（4） 用吸管吸取5 ml 稀釋骨髓液徐徐加入盛有4 ml 的人類淋巴細胞分離液液面之上；（5） 在以

16、上條件下，骨髓有核細胞分層在PBS-人類淋巴細胞分離液之間形成的界面上；（6） 吸取有核細胞層，加入到10 ml PBS液中，混勻；（7） 以1000 prm 離心 5 min ，棄上清；收集骨髓細胞，加固定液或置低溫冰箱備用。2 注意事項（1） 抽骨髓液時，先將注射器針頭、針筒、針栓用肝素浸潤，抽取時力量適中；（2） 在吸取淋巴細胞層時盡量少吸分離液，量應(yīng)掌握在300 ul 左右，這樣有利于洗去多余的分層液；（3） 紅細胞的方法：以等量的蒸餾水加入到沉淀中，輕輕搖動片刻，見粉紅色出現(xiàn)，立即加入大量生理鹽水，混勻，離心，去除上清即可。六 培養(yǎng)細胞的單細胞懸液的制備1 培養(yǎng)細胞的特征高質(zhì)量的單細

17、胞懸液是FCM分析的保證。一般細胞培養(yǎng)分為懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)，由于細胞的增殖，都有可能形成大小不等的細胞團塊或連接成片。如果兩個或多個細胞粘連在一塊或細胞碎片過多都將影響FCM結(jié)果，進而導(dǎo)致實驗失敗。所以，制備合格的培養(yǎng)細胞單細胞懸液十分重要。2 培養(yǎng)細胞樣品的制備程序：（1）將培養(yǎng)細胞用0.04%乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA2Na）或0.29%胰酶消化3-7min，（根據(jù)室溫情況而定），至光鏡下見到貼壁細胞間出現(xiàn)篩狀間隙為止），棄去消化液，加PBS液；（2） 用吸管將細胞從瓶壁上輕輕吹打下來，并移入離心管中；（3） 短時低速離心，即800-1000prm，5 min；（4） 棄上清，加pH7

18、.4的PBS液5-8ml，低速短時離心，800-1000prm，3-5 , min ；重復(fù)2- 3次，以去除細胞懸液中的細胞碎片；（5） 加少許PBS液，將沉淀細胞輕輕吹打均勻。加固定液或低溫保存待用。七 脫落細胞樣品單細胞懸液的制備 在臨床工作中，可以收集到大量自然脫落細胞，這些細胞標本經(jīng)過簡單處理，便可成為較好的單細胞懸液，提供流式細胞術(shù)分析。主要包括脫落細胞、胸腹水細胞、尿液、內(nèi)鏡刷檢細胞等。1 食管拉網(wǎng)細胞的單細胞懸液的制備(1) 將食管拉網(wǎng)器上的細胞洗脫到20 ml PBS液中，以1500 prm 離心后，再用PBS液洗2 次，離心500-800 prm, 1-2 min，棄上清；(

19、2) 再加入PBS液5 ml ，以300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；(3) 加少許PBS液混勻沉淀細胞，加固定液或低溫保存，備用。2 尿液脫落細胞的單細胞懸液的制備（1） 用一清潔器皿收集24小時尿液，置4 冰箱中自然沉淀2小時，輕輕倒去上清液， 留下少許帶細胞的沉淀物，用吸管移至10-20 ml 離心管中；（2） 500 prm 離心 10min ，去上清；（3） 加PBS液8-10 ml，以1000 prm 離心10 min ，去上清；重復(fù)再洗1 次；（4） 再加5 ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；（5） 再加少許PBS液，混勻。加固定液或低溫保存，備用。3

20、 胸、腹水脫落細胞的制備（1） 抽取胸、腹水50-100 ml ，加入1000ui/ml肝素液1 ml ，放鹽水瓶中置于4冰箱 中靜置6-12小時，棄去上清；（2） 10-20ml ，用長吸管移入試管中，用PBS液洗3 次，以1500 prm 離心沉淀5 min ；（3） 再加5 ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；（4） 加少許PBS液，混勻；加固定液或低溫保存，備用。4 沖洗液細胞樣品的制備（1）用300-500 ml 生理鹽水沖洗膀胱,沖洗一定時間后,吸出沖洗液放入容器中于冰箱內(nèi)置6-12小時；（2） 取沉淀液20-40 ml ,離心沉淀并以生理鹽水洗2 次, 吸

21、上清；（3） 加10 mlPBS液，混勻；以300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清；（4） 過濾后1000prm,10 min，離心沉淀，去上清；加固定液或低溫保存?zhèn)溆?。七、網(wǎng)織紅細胞樣品的制備 計數(shù)血液中網(wǎng)織紅細胞的數(shù)量，對估價骨髓中紅細胞的生成活性有重要意義。1 染色原理網(wǎng)織紅細胞是一種未完全成熟紅細胞。在工細胞成熟過程中，其胞漿中的RNA含量逐漸被血紅蛋白所取代，因此，檢測紅細胞中RNA的含量多，就代表了紅細胞的成熟程度。從而成為檢測網(wǎng)織紅細胞的重要方法。2 樣品的制備（1） 抽取全血0.5ml，注入盛有0.5ml的0.1mol/L EDTA溶液中；（2） 用微量取液器及取50lEDTA抗

22、凝血，置于另一離心管中，加入Goods緩沖液5.0ml,離沉淀1000prm,5min，連續(xù)洗3次；（3） 將沉淀細胞加入1.0ml枸椽酸鈉緩沖液，輕輕振蕩懸??；（4） 將懸浮液緩慢注入盛有4ml 0.1%戊二醛緩沖液中固定15min；（5） 上FCM之前，用PBS洗去固定劑，加入0.5ml 0.01%的派若寧工作液；染色30min 離心沉淀去染液，1500prm,5 min；（6） 用PBS洗一次，離心1500prm，5min，去上清，再用PBS將細胞懸浮，上機檢測。八、血小板檢測樣品的制備循環(huán)性血小板在血管受傷部位迅速形成止血栓子，這些細胞也參與因血管壁的改變激發(fā)的血栓形成而引起的血流阻塞

23、。另外，血小板還能吸引和結(jié)集白細胞而參于組織損傷、炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷愈合。血小板膜蛋白（粘附分子）它存在于血小板表面或嵌入-顆粒中，在正常血小板粘附或凝聚過程式中起關(guān)鍵作用。血小板膜糖蛋白主要包括：富亮氨酸糖蛋白（CD42b/CD42a）、整合素（VLA-2）（CD42b/CD29）、整合素（VLA-5）（CD49e/CD29）、整合素-6（VLA-6）（CD49f/CD29）、血小板內(nèi)皮細胞粘附分子-1（PECAM-1）（CD31）、CD36、整合素（CD41/CD61）和P選擇素（CD62p）。1 血小板標記方法全血法單標測血小板CD62p、CD63、CD42b、CD41、CD61等指標。染色

24、方法步驟：（1） 采血枸櫞酸鹽或EDTA抗凝；（2） 10l熒光標記抗體，加100l PBS，再加5l全血（樣品管）；10l抗體同型對照，加100l PBS，再加5l全血（對照管）；輕輕混勻，室溫孵育15min；（3） 加2-3ml PBS（1% PFA）終止反應(yīng)，上機檢測分析。2 全血法雙標記檢測活化血小板（如CD62p-FITC/CD42b-PE）染色方法步驟：（1） 采血枸櫞酸鹽或水蛭素抗凝；（2）10l CD62p-FITC加10l CD42b-PE,再加5l全血；（樣本管）10l IgG1-FITC加10l IgG1-PE,再加5l全血；（對照管） 輕輕混勻，室溫孵育15min;（3） 加 2-3 ml PBS（1.0 PFA）終止反應(yīng)，上機以SS-LOG/CD42b-PE圈定血小板檢測分析。3 流式細胞術(shù)檢測血小板方法學(xué)的注意事項（1） 抗體的選擇：選擇CD workshop 中的單克隆抗體。因為單克隆抗體反應(yīng)特異性高，非特異性結(jié)合少。但由于血小板富含F(xiàn)c R(CD32,Fc受體)，而Fc受體對不同抗體亞類具有不同親合力，所以在亞類選擇上，對于人的抗體以選擇IgG1為好。（2） 抗凝劑的選擇：肝素盡量避免用；EDTA在室溫20-25時其抗凝效果與枸椽酸鹽無差別，但在37時，EDTA就會影響蛋白結(jié)構(gòu)及剌激血小板活化。（3） 標本的采集：一般采少量外周