1、第四章 藥物定量分析與分析方法驗證,第一節(jié)、定量分析方法的特點,一、容量分析法 是將已知濃度的滴定液由滴定管滴加到待測藥物的溶液中，直到所加滴定液與被測藥物按化學計量反應完全為止，然后根據(jù)滴定液的濃度和消耗的體積，就可計算出被測藥物的含量。,滴定終點與等當點不符-滴定誤差，需要選擇合適的指示劑指示終點。,(一)容量分析法的特點1、快速，準確，靈敏度高2、適合于高含量或中含量組分分析3、儀器簡單，操作方便適用范圍廣,(二)容量分析法的計算問題,滴定度：指每1ml某摩爾的滴定液所相當?shù)谋粶y藥物 重量。Chp用mg來表示。 aAbBcCdD T(mg/ml)=m - M 其中，m為滴定液的摩爾濃度，

2、a為被測藥物的摩爾 數(shù)，b為滴定液的摩爾數(shù)，M為被測藥物的毫摩爾質(zhì)量 （分子量）。,b,a,直接滴定法：以滴定液的濃度和體積直接計算含量。,百分含量計算,其中，V是消耗滴定液體積；T為標準滴定度（藥典規(guī)定）；F為相對濃度（實際濃度和標準濃度比值），校正因數(shù)， W為供試品取樣量。,例題 稱取對氨基水楊酸鈉0.4132g，按藥典規(guī)定加水和鹽酸后，按永停滴定法用亞硝酸鈉滴定液（0.1023mol/L）滴定到終點，消耗亞硝酸鈉滴定液22.91ml，求對氨基水楊酸鈉（C7H6NO3Na）的百分含量？分子量175。,生成物滴定法 計算時考慮被測物和生成物以及滴定劑三者之間的化學計量關(guān)系。,剩余滴定法：此法

3、是先加入定量過量的滴定液A，使其與被測藥物反應；待此反應進行完全后，再用另一滴定液B來回滴反應中剩余的滴定液A,1）無空白實驗 含量%=2）空白實驗 含量%=,例題 取標示量為0.5g阿司匹林10片，稱出總重為5.7680g，研細后，精密稱取0.3576g，按藥典規(guī)定用兩次加堿剩余堿量法測定。消耗硫酸滴定液（0.05020mol/L）22.92ml，空白試驗消耗該硫酸滴定液39.84ml，求阿司匹林的含量為標示量的多少？ （T=18.08mg/ml，藥典硫酸標準溶液為0.05mol/L，阿司匹林的分子量180.16）,（一）紫外-可見分光光度法1.特點: 1）靈敏度高，可達10 -4g/ml一

4、10 -7g/ml 2）準確度高，相對誤差為2%一5。 3）儀器價格較低廉，操作簡單，易于普及。 4）應用廣泛。,二、光譜分析法,2.朗伯一比耳定律： A=E l C 式中A一吸收度 l一液層厚度；C一溶液濃度；E一吸收系數(shù)，即單位濃度、單位液層厚度時的吸收度。,3.儀器校正和檢定 4.對溶劑的要求 測定供試品之前，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求。5.測定法 測定時，須作波長校正。并作空白吸收。,（1）對照品比較法：分別配制供試品溶液和對照品溶液，在規(guī)定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸收度后，計算供試品中被測溶液的濃度：,式中Cx為供試品溶液的濃度,Ax為供試品溶液的

5、吸收度，Cr為對照品溶液的濃度,Ar為對照品溶液的吸收度，D為稀釋倍數(shù)，W為供試品取樣量。,含量測定的方法,（2）吸收系數(shù)法：配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸收度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計算含量。,用本法測定時，應注意儀器的校正和檢定。,（3）計算分光光度法 （4）比色法,例題 對乙酰氨基酚的含量測定：取本品42mg，精密稱定，置250ml量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液50ml溶解后，加水至刻度，搖勻，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液10ml，加水至刻度，搖勻，照分光光度法，在257nm的波長處測定吸收度為0.572。按C8H9NO2的吸收系數(shù)為715

6、計算。求對乙酰氨基酚的百分含量？,本法特點為： （1）靈敏度高，其靈敏度可達10-10g/ml一10-12g/ml（2）熒光分析法應在低濃度溶液中進行（3）空白試驗（4）熒光衍生化試劑（5）取樣少，方法快速,(二)熒光分析法,2.含量測定 在每次測定前，用一定濃度的對照品溶液校正儀器的靈敏度；然后在相同條件下，讀取對照品溶液及其試劑空白的熒光讀數(shù)與供試品溶液及其試劑空白的熒光讀數(shù)，用下式計算供試品濃度：,應在0.50-2.0之間,三、色譜分析法 (一) HPLC法：,要求RSD2， 回收率98102之間。 線性范圍： 專屬性：要考查輔料、有關(guān)物質(zhì)或降解產(chǎn)物對主藥的色譜峰是否有干擾，如有干擾應設(shè)

7、法排除。,1.儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填充劑和流動相的組分應按各品種項下規(guī)定。 注樣量一般為數(shù)微升。柱溫一般為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。,正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外、其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相、各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體品種并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。一般色譜圖20分鐘內(nèi)記錄完畢。,2.系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子。,3.測定法 定量測定時，可根據(jù)供試品的具體情況采用峰面積法或峰高法。測定供試品中主成分含量時，常用兩

8、種方法：,(1)內(nèi)標法加校正因子：精密稱取藥物對照品和內(nèi)標物質(zhì)，配成校正因子測定用的藥物對照溶液。測量對照品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：,再取各品種項下含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量：,（2）外標法外標法是以供試品的對照品或標準品作對照物質(zhì)，相比較以求得供試品的含量，要求進樣量準確及操作條件穩(wěn)定。 外標法可分為標準曲線法和外標一點法。,1）標準曲線法：作出峰面積（或峰高）與濃度的標準曲線。測得待測組分的峰面積（或峰高），根據(jù)回歸方程，計算供試品中待測組分的濃度。,2）外標一點法：按下式計算含量：,（

9、二）氣相色譜法流動相為氣體，稱為載氣色譜柱分為填充柱和毛細管柱兩種進樣口的供試品被加熱氣化檢測器,1.系統(tǒng)適用性試驗 同高效液相色譜法項下規(guī)定。2.測定法 同高效液相色譜法項下規(guī)定。 氣相色譜法進行定量分析時，盡可能采用內(nèi)標法為宜。,第二節(jié) 樣品分析的前處理方法,一.概述,含金屬或鹵素的藥物，在分析前需要經(jīng)過不同方法處理后，方可進行測定。 含氮、硫、磷元素的有機藥物,含金屬的有機藥物：一是金屬原子不直接與碳原子相連，常為有機酸及酚的金屬鹽或配位化合物，其分子結(jié)構(gòu)中的金屬原子結(jié)合不夠牢固二是金屬原子直接與碳原子以共價鍵相連接，結(jié)合狀態(tài)比較牢，稱為有機金屬藥物。,酒石酸銻鉀,醋酸苯汞,卡巴胂,硬脂

10、酸鎂,富馬酸亞鐵,葡萄糖酸銻鈉,汞撒利,含鹵素有機藥物系指藥物分子結(jié)構(gòu)中所含鹵素直接與芳環(huán)或脂肪鏈相連者,結(jié)構(gòu)特點：CX,（一）鹵原子的活潑性,1. 鹵原子與碳原子直接相連，鹵原子的活潑性和它直接相連的烴基的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系,（1）乙烯型鹵和芳鹵 不活潑,泛影酸,諾氟沙星,磺溴酞鈉,（2）烯丙型鹵和芐鹵 活潑,（3）鹵代烷型 介于兩者之間,2. 分子中所含鹵原子的個數(shù),分子中所含鹵原子的個數(shù)越多，活潑性越強，特別是同一碳上含多個鹵原子或一個苯環(huán)上含多個鹵原子時，活潑性增強更加明顯。,二、不經(jīng)有機破壞的分析方法,（一）直接測定法 凡金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬藥物或某些CM鍵結(jié)合不牢固的有機

11、金屬藥物，在水溶液中可以電離，因而不需有機破壞，可直接選用適當?shù)姆椒ㄟM行測定。,(1)含銻藥物 (2)含鐵藥物 在酸性溶液中可游離出具有氧化性的Sb5+ 、Fe3+氧化碘化鉀析出碘，用硫代硫酸鈉滴定。（間接碘量法）。,1 配位滴定法,2 氧化還原滴定法,例 葡萄糖酸銻鈉的測定 ChP 取本品約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水100ml、鹽酸15ml與碘化鉀試液10ml，密塞、振搖后，在暗處靜置10min，用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定，至近終點時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每lml的硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當于6.088m

12、g的Sb。,富馬酸亞鐵的含量測定 ChP,取本品約0.3g，精密稱定，加稀硫酸 15ml，加熱溶解后，放冷，加新沸過的冷水50ml與鄰二氮菲指示液2 滴，立即用硫酸鈰滴定液(0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每1ml硫酸鈰滴定液(0.1mol/L)相當于16.99mg,原理,Fe2+ + Ce4+ Ce3+ + Fe3+,（二） 經(jīng)水解后測定法,1. 堿水解后測定法 本法是將含鹵素有機藥物溶于適當溶劑（如乙醇）中，加入氫氧化鈉溶液（或一定量過量的硝酸銀滴定液）后，加熱回流使其水解，將有機結(jié)合的鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機的鹵素離子，然后采用銀量法測定。,本法適用于含鹵素有機藥物結(jié)構(gòu)中鹵素

13、原子結(jié)合不牢固的藥物（如鹵原子和脂肪碳原子相連者）。,原理 三氯叔丁醇在氫氧化鈉溶液中加熱回流水解，氯元素全部轉(zhuǎn)變成氯化鈉，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量過量的硝酸銀滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀，過量的硝酸銀，以Fe3+為指示劑，用硫氰酸銨液回滴定。,例:三氯叔丁醇的測定 ChP（2000）,2. 用硫酸水解后測定法,例 硬脂酸鎂的測定,取本品約0.1g，精密稱定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L) 50ml，煮沸至油滴澄清，繼續(xù)加熱10min，放冷至室溫，加甲基橙指示液12滴，用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相當

14、于2.016mg的MgO。,原理：,例 汞撒利的測定,取本品約0.5g，精密稱定，加蒸餾水10ml，置冰浴中，滴加硫酸10ml，隨滴隨攪拌，至產(chǎn)生的沉淀復溶解，再加蒸餾水50ml，硫酸鐵銨指示液2ml，用硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)相當于25.29mg的汞撒利。,本法適用于測定結(jié)構(gòu)中碘與苯環(huán)直接相連，且一個苯環(huán)上含多個碘原子的含鹵素有機藥物。,(三) 經(jīng)氧化還原后測定法,1.堿性還原后測定,（如鋅粉）,例 泛影酸的測定,取本品約0.4g，精密稱定，加氫氧化鈉溶液30ml與鋅粉1.0g，加熱回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗滌，濾過，燒瓶

15、與濾器用水洗滌3次，每次15ml，洗液與濾液合并，加冰醋酸5ml與曙紅鈉指示液5滴，用硝酸銀滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當于20.46mg的C11H9 I 3N2O4。,ChP收載的膽影酸、碘番酸、膽影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法測定。,醋酸酸性條件鋅粉還原 碳一碘鍵斷裂 形成無機碘化物,2. 酸性還原后測定法,取本品的干燥品約0.4g，精密稱定，加鋅粉1g及冰醋酸10ml，加熱回流30min，放冷，冷凝管用水30ml洗滌，用脫脂棉過濾，燒瓶與脫脂棉用水洗滌2次，每次20ml，洗液與濾液合并，加四溴酚酞乙酯指示液1ml ，用硝酸銀滴定液(0

16、.1mol/L)滴定。終點時黃色沉淀變?yōu)榫G色。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當于19.031mg的C11H12 I 3NO2。,例 碘番酸的測定,三、經(jīng)有機破壞的分析方法,適用于金屬、鹵素、氮、硫等與碳原子結(jié)合牢固的有機藥物。,(一) 濕法破壞 本法適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞，有機金屬藥物破壞，氮、硫、磷測定法的前處理。 1. 硫酸-高氯酸法 2. 硫酸-硝酸法 3. 硫酸-硫酸鹽法,硫酸-硫酸鹽法 用于含砷或銻有機藥物的破壞，破壞得到的無機金屬離子多為低價態(tài)。 含氮有機藥物,凱氏定氮法,1.原理 2.儀器裝置 3.消解劑,注意事項：1.濕法破壞所用的儀器，一般為硅玻璃或硼

17、玻璃制成的凱氏燒瓶；2.所用試劑及蒸餾水均不應含有被測金屬離子或干擾測定的其他金屬離子等組分；3.由于整個操作過程所用礦酸量數(shù)倍于樣品，所以必須按相同條件進行空白試驗校正；4.操作時應在通風櫥內(nèi)進行。,(二) 干法破壞,適用于濕法不易破壞完全的有機物以及某些不能用硫酸進行破壞的有機藥物。,將適量樣品置于坩堝中，混合均勻后，先小火加熱，使樣品完全炭化，然后放入高溫爐中灼燒，使其灰化完全，即可。,1 高溫熾灼法,常加無水碳酸鈉或氧化鎂等以助灰化,Ca(OH)2法 (含砷樣)稱5g樣+5g Ca(OH)2于蒸發(fā)皿加少量水均勻保溫炭化500馬福爐灰白色冷卻加6N HCL溶解定容50ml,2 氧瓶燃燒法

18、,（1）原理,將有機藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測物質(zhì)吸收于適當?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進行鑒別、檢查或含量測定。,適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機藥物的分析,本法特點是簡便、快速、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析,（ 2） 儀器與材料,儀器裝置 燃燒瓶為500、1000或2000ml無色、磨口、厚壁、硬質(zhì)玻璃錐型瓶；瓶塞空心，底部熔封鉑絲一根，下端呈螺旋狀或網(wǎng)狀,稱樣用材料及稱樣 A. 固體樣品 無灰濾紙 B. 液體樣品 紙袋,C. 軟膏類樣品：將樣品置蠟油紙中包裹嚴密，外層再用無灰濾紙包裹,氧瓶燃燒法裝置與樣品包裝操作圖,吸收液,

19、A. 作用,氧氣,B. 吸收液的選擇,氟 水 氯 NaOH溶液 溴 H2O-NaOH, SO2 碘 H2O-NaOH 硫 濃H2O2 硒 硝酸溶液,（3）操作方法,燃燒瓶燃燒前的準備 洗凈后，加入吸收液，瓶口濕潤，通入氧氣1min，用表面皿覆蓋瓶口。 樣品的準備 取樣品，精密稱定，包裹，固定于鉑絲下端的網(wǎng)內(nèi)或螺旋處。,樣品的燃燒 點燃包有供試品的濾紙尾部，迅速放入燃燒瓶中，按緊瓶塞，加水少量封閉瓶口，燃燒完畢（應無黑色碎片），充分振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量沖洗瓶塞及鉑絲，合并洗液及吸收液，同法另做空白試驗。然后按各藥品項下規(guī)定的方法進行鑒別、檢查或含量測定。,

20、根據(jù)被燃燒分解的樣品量選用適宜大小的燃燒瓶。,（4）注意事項,測定含氟有機藥物時，用石英制 燃燒瓶,鉑絲燃燒時起催化作用,應同時做空白試驗,燃燒時要注意防爆,燃燒要完全,燃燒產(chǎn)生的煙霧完全被吸收,例 碘苯酯的含量測定,原理 碘苯酯系有機碘化物，用氧瓶燃燒分解，轉(zhuǎn)變?yōu)榈饣铮^而氧化為游離的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氫氧化鈉反應，生成碘化物與碘酸鹽，加入溴-醋酸溶液，使全部轉(zhuǎn)變?yōu)榈馑猁}，過量的溴以甲酸及通空氣去除。加入碘化鉀，使與碘酸鹽反應析出游離碘，用硫代硫酸鈉液滴定，碘與淀粉結(jié)合所顯的藍色消失即為終點。,（5）應用,取本品約20mg，精密稱定，照氧瓶燃燒法進行有機破壞，用氫氧化鈉試液2

21、ml與水l0ml為吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液(取醋酸鉀10g，加冰醋酸適量使溶解，加溴0.4ml，再加冰醋酸使成1000m1)l0ml，密塞，振搖，放置數(shù)分鐘，加甲酸約lml，用水洗滌瓶口，并通入空氣流約35min以除去剩余的溴蒸氣，加碘化鉀2g，密塞，搖勻，用硫代硫酸鈉滴定液(0.02 Mol/L)滴定，至近終點時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每lml的硫代硫酸鈉滴定液(0.02mol/L)相當于1.388mg的C19H29IO2。,例 碘苯酯的含量測定,（5）應用,1. 氧瓶燃燒法中的裝置有 A. 磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶 B. 磨口軟質(zhì)玻璃錐形瓶 C

22、. 鉑絲 D. 鐵絲 E. 鋁絲,2.選擇氧瓶燃燒法所必備的實驗物品 A. 磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶 B. 鉑絲 C. 普通濾紙 D. 氫氣 E. 無灰濾紙,3氧瓶燃燒法測定含氯有機藥物時所用的吸收液多數(shù)為 A. H2O2溶液 B. H2O2NaOH溶液 C. NaOH溶液 D硫酸肼飽和液 E. NaOH硫酸肼飽和液,4. 氧瓶燃燒法可用于 A. 含鹵素有機藥物的含量測定 B. 醚類藥物的含量測定 C. 檢查甾體激素類藥物中的氟 D. 檢查甾體激素類藥物中的硒 E. 芳酸類藥物的含量測定,第三節(jié) 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證,一)目的,證明所采用的分析方法適合于相應的檢測要求，方法驗證過程和結(jié)果均應記載

23、在藥品標準起草和修訂說明中。,二)用途,（一）藥品質(zhì)量標準起草時，分析方法需經(jīng)驗證。,（二）藥物合成方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進行修訂時，分析方法需經(jīng)驗證。,三)需驗證的分析項目,1. 鑒別試驗； 2. 雜質(zhì)定量或限度檢查； 3. 原料或制劑中有效成分含量測定； 4. 制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的測定； 5. 溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法。,驗證內(nèi)容有：準確度、精密度（重復性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。,四)驗證內(nèi)容,一、 準確度（accuracy） 準確度是指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，用百分回收

24、率表示。,測定回收率R（recovery）的具體方法可采用“回收試驗法”和“加樣回收試驗法”。,回收試驗 空白+已知量的對照品（或供試品）測定。,原料藥可用已知純度的對照品或樣品進行測定，或用本法所得結(jié)果與已建立準確度的另一方法測定的結(jié)果進行比較。,加樣回收試驗 已準確測定藥物含量的真實樣品+已知量的對照品（或標準品）測定。,制劑可用含己知量被測物的各組分混合物進行測定，即采用在空白輔料中加入原料藥對照品的方法。 如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測物進行測定，或與另一個已建立準確度的方法比較結(jié)果。,數(shù)據(jù)要求 規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果評價，如制備三個不同濃度樣品各測三次

25、。,中藥分析的準確度一般用加樣回收試驗衡量。中藥回收率一般要求在95105%范圍內(nèi)，有些方法操作步驟繁多時，可要求在90110%范圍內(nèi)。RSD一般在3%以內(nèi)。,二、精密度（precision） 是指在規(guī)定條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。用偏差（d）、標準偏差(SD)、相對標準偏差(RSD)（變異系數(shù)，CV）表示。,偏差（d）：測量值與平均值之差,標準（偏）差（SD或S）,相對標準（偏）差（RSD），也稱變異系數(shù)（CV）,1. 重復性 在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度；在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果評價，如制備三個不同濃度樣品各測三次或把被測物濃度當作100%，至少測6次進行評價。,2. 中間精密度 同一實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備所得結(jié)果的精密度?？疾祀S機變動因素的影響。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備。,3. 重現(xiàn)性 不同實驗室，不同分析人員測定結(jié)果的精密度。當分析方法將被法定標準采用時，應進行重現(xiàn)性試驗。如建立藥典分析方法時通