1、常規(guī)培養(yǎng)基制作,疾控中心 歲 源 E-mail： Tel：13656101610 QQ： 37316315,第一節(jié) 基本理論,培養(yǎng)基的定義： 培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物所需要的各種營養(yǎng)物質，由人工配制而成的營養(yǎng)基質，它專供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用。 培養(yǎng)基的用途： 主要用于繁殖及分離純化細菌、傳代和保存菌種、鑒別細菌種屬、研究細菌生理及生化特性、制造菌苗、疫苗和其他微生物制劑等。,一、培養(yǎng)基的分類,1.按用途分類： 基礎培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基 、選擇性培養(yǎng)基 、鑒別培養(yǎng)基 、顯色培養(yǎng)基,基礎培養(yǎng)基 含細菌所需最基本營養(yǎng)成分，可供大多數(shù)

2、細菌生長。常用的如含適量蛋白胨、氯化鈉、磷酸鹽、pH7.2-7.6的營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂。 營養(yǎng)培養(yǎng)基 基礎培養(yǎng)基再加入一些其他營養(yǎng)成分，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏、生長因子等，以滿足營養(yǎng)要求較高的細菌生長繁殖所需要的營養(yǎng)。,增菌培養(yǎng)基 多為液體培養(yǎng)基，主要目的是增加標本中目的菌數(shù)量，以提高目的菌檢出率。 選擇性培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中加入抑制物質，使之具有選擇性，有利于目的菌檢出和識別，而抑制其他非目的菌生長或者使其生長不佳。,加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基：分離酵母菌、霉菌等真菌 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基：分離金黃色葡萄球菌 不加氮源的無氮培養(yǎng)基：分離固氮菌 不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基：分離自養(yǎng)型微

3、生物 加入氨基嘌呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基：分離雜交瘤細胞,鑒別培養(yǎng)基 利用各種細菌分解糖類和蛋白質的能力及其代謝產(chǎn)物的不同，即生化反應能力不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，以此來區(qū)別各種細菌。主要用于檢查各種細菌的生化反應。 如伊紅美藍培養(yǎng)基可鑒別大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物有機酸與伊紅美藍結合，使菌落呈現(xiàn)綠色金屬,大腸桿菌EMB平板,沙門氏菌BS瓊脂,沙門氏菌XLD（木糖賴氨酸去氧膽酸鹽）瓊脂,顯色培養(yǎng)基 細菌在生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性酶，按酶的特性，選用相應底物和指示劑，將其配制在相關培養(yǎng)基中。根據(jù)細菌反應后出現(xiàn)的菌落顏色變化，確定待分離可疑菌株，有助于細菌快速診斷

4、。,副溶血性弧菌,副溶API 20E,2.按物理性狀分類,液體培養(yǎng)基 流體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基：不含凝固劑，利于菌體的快速繁殖、代謝和積累產(chǎn)物 流體培養(yǎng)基：含0.05-0.07%瓊脂粉，可降低空氣中氧進入培養(yǎng)基的速度，利于一般厭氧菌的生長繁殖 半固體培養(yǎng)基：含0.2-0.8%瓊脂粉，多用于細菌的動力觀察、菌種傳代保存及貯運細菌標本材料； 固體培養(yǎng)基：含1.5-2%瓊脂，用于細菌的分離、鑒定、菌種保存及細菌疫苗制備等多方面,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,半固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基： 主要用于工業(yè)生產(chǎn)； 固體培養(yǎng)基： 主要用于分離、鑒定等； 半固體培養(yǎng)基： 主要用于觀察、保藏菌種。

5、,3.按成分分類,合成培養(yǎng)基 由化學物質和成分已知的各種物質所組成，可以是無機鹽和有機物質等。 天然培養(yǎng)基 由化學物質不完全清楚或各批物質很難一致的天然物質所組成，如蛋白胨、牛肉膏、血液、馬鈴薯等。 半合成培養(yǎng)基 由不明化學成分的天然物質和 已知化學成分的物質組成,天然培養(yǎng)基 化學成分不明確，主要用于工業(yè)生產(chǎn)； 合成培養(yǎng)基 化學成分明確，主要用于分類、鑒定。,天然培養(yǎng)基： 優(yōu)點：取材便利、營養(yǎng)豐富、配制簡便； 缺點：營養(yǎng)成分難以控制、實驗結果的重復性較 差。 天然培養(yǎng)基如培養(yǎng)細菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。,合成培養(yǎng)基: 優(yōu)點：化學成分及其含量明確、實驗

6、的可重復性好； 缺點：配制繁瑣、成本較高。,二、培養(yǎng)基的主要成分及其作用,1.營養(yǎng)物質：細菌在生長繁殖過程中所需要的營養(yǎng)成分，因細菌種類不同而異，有的對營養(yǎng)要求不高，僅需碳源、氮源即可；有的則要求較高，除碳源、氮源外，還需要雞蛋、血清、血液等。 主要有蛋白胨、牛肉浸液、牛肉浸膏、糖醇類、血液、雞蛋和動物血清、生長因子、無機鹽類等。,1.1蛋白胨：蛋白胨是培養(yǎng)基中作為氮源應用最廣泛的基本成分，它用于合成菌體蛋白質、酶類以及細菌生長繁殖。 其特點是易溶于水，吸水性強，故須干燥密封保存。 此外，蛋白胨受高熱不凝固，遇酸不沉淀，在培養(yǎng)基中具緩沖作用，并含有各種游離氨基酸，易被細菌所利用。,蛋白胨是動物

7、或植物蛋白質經(jīng)酶或酸堿分解而產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。 蛋白質消化越徹底，含氨基酸越多，越有利于細菌生長繁殖。由于蛋白質來源不同，消化程度不同，制成的胨質量相差很大。 通常的商品蛋白胨是由胃蛋白酶消化蛋白質而制成的含胨、多肽及多種氨基酸的混合物，可供大多數(shù)細菌生長需要。其缺點是含某些氨基酸較少。 胰蛋白胨是胰蛋白酶在堿性條件下消化蛋白質所獲得的分解產(chǎn)物，其中含有很多氨基酸和多肽，特別是富含色氨酸，更適合作靛基質試驗用的蛋白胨水。,1.2牛肉浸液,牛肉浸液是將新鮮不含脂肪、肌膜、肌腱等精牛肉浸泡煮沸制成的肉汁。 包括兩類浸出物。一類為含氮可溶性浸出物（如肌酸、尿酸、腺苷酸、黃嘌呤、核苷酸、尿素、谷氨酸、肌

8、肽等），另一類為非含氮浸出物質（如肝糖、磷酸己糖、乳糖、琥珀酸、肌醇、脂肪與無機鹽等）。 牛肉浸液可作為細菌氮源和碳源，但因含氮物質較少，尚不能滿足細菌生長需要。,1.3牛肉浸膏,為牛肉浸液經(jīng)長時間加熱，蒸發(fā)掉水分后濃縮而成的膏狀制品。 牛肉浸液中的不耐熱物質如糖類等已被破壞，因而其營養(yǎng)價值不如肉浸液，但其因不含糖和使用方便，故可作腸道細菌鑒別培養(yǎng)基基礎成分。,1.4糖、醇類,糖類是細菌生長繁殖所需的碳源、能源的基本成分。 最常用的單糖是葡萄糖、阿拉伯糖等；雙糖是乳糖、蔗糖等；多糖有菊糖和淀粉. 醇類有甘露醇、衛(wèi)矛醇等。其他的糖類和醇類主要用于發(fā)酵反應以及鑒定細菌。 糖不耐熱，過久的高熱會被破

9、壞，在堿性及與氮源一起高溫情況下，破壞更快，制備這類培養(yǎng)基時，通常不用高溫，并與培養(yǎng)基中其他成分分別滅菌。,1.5血液,培養(yǎng)基中加入血液，可增加蛋白質、多種氨基酸、糖類、無機鹽等營養(yǎng)成分，同時還能提供輔酶、血紅素等特殊生長因子，供某些對營養(yǎng)要求高的細菌生長繁殖之用。 此外，含血液的培養(yǎng)基還可以用于觀察細菌溶血反應，作為細菌鑒定的一項指標。,血平板溶血現(xiàn)象,1.6雞蛋和動物血清,雞蛋和動物血清對一部分細菌來說是必須營養(yǎng)成分，可作為養(yǎng)料直接被細菌利用。 常用于制備特殊培養(yǎng)基，如Braid-Praker瓊脂培養(yǎng)結核桿菌的羅氏培養(yǎng)基和白喉棒狀桿菌的呂氏血清培養(yǎng)基等。 此外雞蛋和血清還具有凝固劑作用，便

10、于觀察細菌菌落形態(tài)和生長情況。,1.7生長因子,在細菌生長繁殖過程中，需要一定的輔助生長因子。 生長因子根據(jù)化學結構及代謝功能不同分為三大類：維生素、氨基酸和嘌呤與嘧啶。 細菌對這些物質需要量不大，但如缺少，某些細菌就不能生長。通常肝浸液、肉浸液、酵母浸液和血液中含有大部分生長因子，但有時需要另外加入。,1.8無機鹽類,制備培養(yǎng)基時常加入氯化鈉和磷酸鹽，這是因為細菌生長繁殖需要無機鹽類，如K、Na、Mg、Fe、磷酸鹽、氯化物等。 其中，有的需要量極微，如Mn、Cu等。這些無機離子除作為構成菌體的成分外，還是酶的激活劑，并起維持一定滲透壓的作用。,2.水分,細菌細胞75%-80%由水組成。 水是

11、細菌營養(yǎng)、代謝過程中不可缺少的物質；水又是良好的溶劑，培養(yǎng)基中許多營養(yǎng)物質均需溶于水才能被細菌吸收。 蒸餾水和離子交換水不含雜質，在制備培養(yǎng)基時，一般需使用蒸餾水和離子交換水。 無蒸餾水可以用自來水代替，因其中含有某些微量元素，有利于細菌生長，但應先煮沸使部分鹽類沉淀，過濾澄清后再使用。,3.凝固物質,配制固體培養(yǎng)基的凝固物質有瓊脂、明膠和蛋白、血清等，最常用瓊脂，特殊目的也可用明膠等。 瓊脂是從石花菜等海藻中提取出來的一種膠狀物質，屬多糖類，一般不被細菌分解利用，無營養(yǎng)價值。 瓊脂在98攝氏度以上融化，在低于45攝氏度時則凝固成膠凍狀態(tài)。 用途不同的培養(yǎng)基中瓊脂含量不同，固體培養(yǎng)基含量為2%

12、-2.5%，半固體培養(yǎng)基瓊脂含量為0.3%-0.5%。,4.抑制劑和指示劑,抑制劑和指示劑是由于選擇、鑒定和判斷結果的需要而加入到培養(yǎng)基中的物質，并不為細菌生長繁殖所需。 4.1抑制劑加入目的是抑制非檢出菌生長或其少生長，以利于檢出菌生長。根據(jù)所要抑制選擇不同抑制劑。 常用抑制劑有膽鹽、煌綠、玫瑰紅酸、亞硫酸鈉、四硫磺酸鹽、疊氮鈉及一些染料和某些抗生素等。在選擇抑制劑時需注意抑制劑應具有選擇性抑制作用。,4.2指示劑是為方便了解和觀察細菌是否利用和分解培養(yǎng)基中糖、醇類物質，而在培養(yǎng)基中加入的成分。 常用指示劑多為酸堿指示劑，如酚紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍、中性紅、甲基紅、堿性復紅等，還有氧化還

13、原指示劑，如亞甲藍。 此外，一些新的氧化還原指示劑如四氮唑鹽類等，也已廣泛用于細菌快速培養(yǎng)和鑒定以及快速藥敏試驗方面。,三、培養(yǎng)基配制原則：,（1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因為不同的微生物對培養(yǎng)物質的需求不同。 （2）營養(yǎng)要協(xié)調：注意各種營養(yǎng)物質的濃度和比例。 （3）pH要適宜：各種微生物適宜生長的pH范圍不同。 細菌pH為：6.5-7.5； 放線菌pH為：7.5-8.5； 真菌pH為：5.0-6.0。,第二節(jié) 實驗內容,一、實驗目的,掌握在真菌、細菌、放線菌分離培養(yǎng)工作中常用的合成和半合成培養(yǎng)基配制的一般原理、方法、程序、環(huán)節(jié)及要求和注意事項。,二、實驗

14、原理,培養(yǎng)基的配制是進行微生物學實驗工作的重要基礎。由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方組成及配制方法雖各有差異,但一般培養(yǎng)基配制的常規(guī)程序卻大致相同，例如器皿的準備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)。,肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種廣泛用于培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基，屬于半合成培養(yǎng)基。其主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。它們分別提供微生物生長繁殖所需要的碳源、氮源、能源、生長因子和無機鹽等。 培養(yǎng)基都是水溶液，這是因為一切生物細胞都必須要有水的參與。,高氏一號培養(yǎng)基是一種用于培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。培養(yǎng)

15、基中的可溶性淀粉作為碳源和能源，KNO3作為氮源，K2HPO4、MgSO4和FeSO4作為無機鹽等。,馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基被廣泛用于培養(yǎng)酵母菌和霉菌，為半合成培養(yǎng)基。食品檢測國標使用虎紅培養(yǎng)基。,1.培養(yǎng)基的配制過程,1.1液體培養(yǎng)基的配制 1.1.1稱量 一般可用1/100粗天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品。先按培養(yǎng)基配方計算各成分的用量然后進行準確稱量。 注意：染料、指示劑、膽鹽等物質何時加入？調整pH后。 1.1.2溶化 將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水，然后加熱溶解，并不斷用玻璃棒攪動。 注意：含銅大于0.3mol/L時，細菌不易生長；含鐵大于0.14mol/L妨礙細菌產(chǎn)生毒素。,

16、1.1.3定容,待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。 問：如某種藥品用量太少如何稱量？ 答：可先配置成較濃溶液，然后按比例吸收一定體積溶液，加入到培養(yǎng)基中。,1.1.4調PH,一般用pH試紙測定培養(yǎng)基pH。用剪刀剪出一段pH紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀察其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液進行調節(jié)。 注意：調節(jié)pH時，應逐漸加入NaOH或HCl溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直至達到所需pH為止。,注：一般將培養(yǎng)基pH調整高出所需值的0.1-0.2個pH單位，經(jīng)高壓滅

17、菌后，其pH要降低0.1-0.2個單位。,1.1.5過濾,用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時，此步可省去。,1.2固體培養(yǎng)基的配制,配制固體培養(yǎng)基時，應將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補足因蒸發(fā)而失去的水分。,2.培養(yǎng)基的分裝,根據(jù)不同需要，可將已配好的培養(yǎng)基分裝入試管或錐形瓶內，分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。 如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。,2.1試管的分裝,取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端

18、再與玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾住玻璃嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內。 注：分裝在不同規(guī)格三角燒瓶、試管等容器中，分裝量不宜超過容器的2/3，否則會溢出。,裝入試管培養(yǎng)基的量，視試管大小及需要而定。若所用試管大小為15*150mm時，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1/4左右為宜； 如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時，瓊脂完全融化后，應趁熱分裝于試管中。,2.2錐形瓶的分裝,用于振蕩培養(yǎng)微生物時，可在250ml錐形瓶中加入50ml的液體培養(yǎng)基； 若用于制作平板培養(yǎng)基時，可在250ml錐形瓶中加入150

19、ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉（按2%計算）。滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。,3.棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎,為了培養(yǎng)好氧性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或錐形瓶內空氣先進行過濾，除菌。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞等。,3.1試管棉塞的制作,制棉塞時，應選取用大小，厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的圓孔中，用右手食指將棉花從中央壓入圓孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口。 也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊法制作棉塞。制作的棉塞應緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準。 棉

20、塞的2/3在試管內，1/3在試管外。,將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用鉛筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌待用。,3.2錐形瓶棉塞制作,通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上。在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包上8層紗布或蓋好培養(yǎng)容器封口膜的錐形瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線捆好，滅菌待用。,4.培養(yǎng)基的滅菌,下一章節(jié)詳述。,5.斜面和平板的制作,5.1斜面的制作 將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱傾斜固定，凝固后即成斜面。斜面長度不超過試管長度1/2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時，滅菌后則

21、應垂直放置至冷凝。,葡萄糖：乳糖1：9 下黃上不黃 為分解葡萄糖，不分解乳糖 上下均黃 為分解葡萄糖、乳糖 上下均不黃 為非發(fā)酵菌 中間變?yōu)楹谏珵楫a(chǎn)H2S,5.2平板的制作,將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，冷卻至50攝氏度左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。 溫度過高時，皿蓋上冷凝水太多，溫度低于50攝氏度，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。 平板的制作應在酒精燈旁進行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿錐形瓶的底部或試管，左手同時用小指和手掌將棉塞打開，灼瓶口。 用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫。置于桌上，輕輕旋轉平皿。使培養(yǎng)基均勻分布于整個平皿中，冷凝后即成平板。,三、實驗材料,3.1藥品 牛肉膏、蛋白胨、N

22、aCl、酵母膏、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO47H2O和FeSO47H2O、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂等。,3.2溶液,1mol/LNaOH、1mol/LHCl。,3.3儀器,天平、高壓蒸汽滅菌器。,3.4玻璃器皿,移液管、試管、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。,3.5其他常用器皿,藥匙、pH試紙、稱量紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙、報紙等。,四、實驗內容,4.1肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 4.1.1培養(yǎng)基成分 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂 15-20g 水 1000ml Ph 7.2,4.1.2配制方法,（1）稱量及融化 分別稱取蛋白胨和NaC

23、l的所需量，置于燒杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸餾水，用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一燒杯中，進行稱量。然后加入少量蒸餾水于小燒杯中，加熱融化。倒入上述燒杯中。將燒杯置于石棉網(wǎng)上加熱，用玻璃棒攪拌，使藥品全部融化。,（2）調Ph 待溶液冷卻至室溫時，用1mol/lNaOH溶液調pH至7.2。 （3）定容 將溶液倒入量筒中，補充水量至所需體積。 （4）加瓊脂 加入所需量的瓊脂，加熱融化，補充失水。 （5）分裝、加塞、包扎。 （6）高壓蒸汽滅菌0.1MPa滅菌20min。,4.2高氏合成一號培養(yǎng)基 4.3馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基,4.4培養(yǎng)基使用注意事項,配制培養(yǎng)基所用的化學藥品，均應化學純凈。 配制培養(yǎng)基時各種成分應準確稱量。 培養(yǎng)基的酸堿度，必須準確測定，特別對含有指示劑的培養(yǎng)基；測定酸堿度須于冷卻后測定為準。 制備的培養(yǎng)基必須保持澄清，以便細菌生長后，容易觀察。液體培養(yǎng)基沉淀法和濾紙法；固體培養(yǎng)基可用脫脂棉花濾清。,培養(yǎng)基使用注意事項,培養(yǎng)基必須達到完全無菌的目的。要注意有些培養(yǎng)基高壓滅菌的磅數(shù)不可過