1、IEF使用過程中常見問題及解決方法以下為IEF在使用過程中可能會碰到的問題，詳細情況請閱讀說明書。如果操作錯誤或系統(tǒng)錯誤時，相應的錯誤信息會顯示在液晶屏上。同時系統(tǒng)的電源供應會在錯誤信息顯示時自動切斷。問題可能原因 解決方法初始電流低或為零 IPG膠條與電極接觸不好. 檢查IPG膠條與電極的接觸情況，確保聚焦槽的蓋子正確地合上. PROTEAN IEF等電聚焦儀與聚焦盤電極接觸不完全. 檢查聚焦盤的放置位置，確保PROTEAN IEF等電聚焦儀與聚焦盤電極正確接觸. IPG膠條水化不完全 確保IPG膠條完全并平均地進行水化。檢查水化液體積及水化時間. 在升壓過程中電壓不上升. 鹽濃度過高 檢查

2、鹽濃度并對樣品進行除鹽處理. 電壓未能達到預設電壓或達到極限電壓過程非常緩慢 Bio-Lyte濃度過高 將Bio-Lyte 濃度降至 0.2% (v/v). 對不同尺寸的IPG 膠條和pH梯度電壓設置過高. 在聚焦時請用伏小時進行編程，以確保樣品的完全聚焦. 過多的樣品在水化過程中未能進入膠條, 或IPG膠條因過多的樣品導致過度泡漲 如果使用了超過了推薦的樣品體積量，確保所有樣品能進入膠條, 或在聚焦前除去多余的樣品液. 電壓及電流波動很大. (同時電阻錯誤信息會顯示) IPG膠條中有水化較差的區(qū)域, 或IPG 膠條在運行過程中已經(jīng)燒干. 檢查水化緩沖液體積及時間. 確保在水化期間水化緩沖液平

3、均地分配. 限流過高. 建議限流50A/膠條. 確保輸入正確的IPG膠條數(shù)目. 問題可能原因解決方法 燒膠條 (這將會導致電阻較大的波動，并引起電阻錯誤信息顯示.) 限流過高. 建議限流50A/膠條. 確保輸入正確的IPG膠條數(shù)目. IPG 膠條已經(jīng)燒干. 確保IPG膠條被礦物油或類似物所覆蓋以防止膠條燒干 電極處的濾紙過濕或含有不合適的電極溶液. 確保濾紙電極只含有去離子水并且處于潤濕狀態(tài)而非潮濕狀態(tài). 水化緩沖液成份不合適, 鹽濃度過高. 檢查水化緩沖液濃度。必要時重新配制緩沖液. 雙向電泳實驗中常見問題 一、 水平條紋出現(xiàn)的問題:膠上出現(xiàn)連續(xù)性橫紋。可能的原因:蛋白質(zhì)沒有完全和穩(wěn)定溶解。

4、推薦解決的方法: 用適當強烈的離液劑抽提蛋白，確保所有的蛋白質(zhì)都溶解。因此選擇合適濃度的尿素，硫尿，去污劑（e.g.CHAPS, ASB-14），兩性電解質(zhì)和還原劑（DTT or TBP）非常重要。每一種新的樣品，都需要其相適應的樣品處理方法。為處理好樣品，現(xiàn)提供以下幾個樣品標準處理溶液： o 89 M urea, 4% (w/v) CHAPS, 2 mM TBP or 50 mM DTT, 40 mM Tris, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 Ampholyte o 7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 2 mM TBP or 5

5、0 mM DTT, 40 mM Tris, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 Ampholyte 樣品須有充分的溶解時間和變性時間。通常，在進行一相等電聚焦前，須將樣品水化液在室溫平衡1小時左右。 進行一相等電聚焦前，須對蛋白樣品進行充分離心（10,000 rpm），去除樣品中的不溶的蛋白復合物。 推薦產(chǎn)品:ReadyPrep protein extraction kit (total protein/全蛋白)出現(xiàn)的問題:出現(xiàn)不連續(xù)的橫紋?？赡艿脑?樣品中含有干擾物質(zhì),比如鹽類,離子去污劑(SDS),肽類,核酸類(e.g.DNA, RNA),脂類,多糖和酚類化合物。推薦解決的

6、方法:以下是我們針對不同雜質(zhì)推薦的不同去除方法。更詳細的信息請參閱Rabilloud （1996）.鹽：為確保IEF順利完成,樣品中的總鹽類不得超過40mM。樣品中的鹽類物質(zhì)可以通過透析,凝膠過濾,蛋白濃縮,或者蛋白沉淀后再復溶等方法減少或除去。蛋白質(zhì)沉淀可以選用10%TCA丙酮處理 （Damerval et al. 1986）,也可選用ReadyPrep 2-D cleanup kit。沉淀后，可以選用IEF/2-D上樣緩沖液重新溶解蛋白樣品。注意在蛋白復溶前將沉淀試劑完全去除。陰離子去污劑：SDS是一種十分有效的去污劑，用于溶解難溶的蛋白。SDS可以迅速使樣品中的蛋白酶失活，并減少脂類物質(zhì)

7、對IEF的影響。但是由于其強陰離子的特性會干擾一相等電聚焦，因此在樣品處理時就要注意其對樣品的影響。如果在樣品制備中使用SDS，那么在一相等電聚焦前，須用含有過量兼性離子或中性離子的溶液稀釋樣品以降低SDS的干擾。最終，樣品中SDS的含量須低于0.25% (w/v)，樣品中其他去污劑和SDS之比至少應大于8：1。如果前述方法不足以去除樣品中的SDS，那么可以將蛋白質(zhì)多步清洗后沉淀來清除SDS，并用前面所介紹去除鹽類物質(zhì)的樣品緩沖液重新溶解蛋白質(zhì)。核酸：處理培養(yǎng)細胞和從組織中分離的細胞時，往往造成很高的蛋白/核酸比率。核酸物質(zhì)會增加樣品的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，從而阻止蛋白滲入膠條，并

8、會緩慢遷移形成條帶。同時，核酸還會和蛋白通過離子間作用力結合，造成假遷移使2-D膠上出現(xiàn)橫紋。通常使用核酸內(nèi)切酶酶解核酸是最為直接的方法。在樣品中加入 0.1x solution containing 1 mg/ml DNase I, 0.25 mg/ml RNase A, and 50 mM MgCl2 而后冰浴 (Blomberg et al. 1995). 注意：Mg2+離子是DNase活性所必須的。多聚糖類：同核酸一樣，高分子糖聚合物可能堵住膠孔從而影響IEF。此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所帶的負電荷能和蛋白質(zhì)作用，從而在2-D膠上形成橫條紋。建議通過TCA/丙酮沉淀(Da

9、merval et al. 1986)；或者醋酸銨沉淀后酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986)；或者使用 ReadyPrep 2-D cleanup kit處理樣品。脂類：蛋白質(zhì)能和脂類通過疏水力互相作用，在2-D膠上造成假象。在水化液中，脂蛋白復合物可能完全不溶，也就不能滲進膠條中的聚丙烯酰氨凝膠中去。一個破壞脂-蛋白間作用力的方法就是提高去污劑的濃度有些樣品在復溶前, 須用有機溶劑破壞脂鍵，常用的是甲醇和氯仿的混合物(Wessel and Flugge 1984)。酚類化合物：植物組織含有大量的酚類化合物，它們往往以氫鍵和蛋白質(zhì)相互強烈作用。這些化合物有可能通過酶的催化使

10、蛋白氧化，形成共價鍵修飾蛋白。酚類化合物的影響，可以通過以下方法去除。1. 酚類化合物可以被polyvinylpyrrolidone (PVP) or polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)吸附。2. 樣品制備中加入DTT，抗壞血酸，亞硫酸鹽可以防止酚類氧化作用。3. 氧化酚類的酶可以被制備樣品時所用裂解液中的硫尿所抑制。4. 裂解的液氮凍存的樣品可以直接加入強變性劑混合物 如 TCA/丙酮 (Damerval et al. 1986).，可以抑制酚氧化。推薦產(chǎn)品:ReadyPrep 2-D cleanup kitBio-Spin/Micro Bio-Spin 6 co

11、lumns出現(xiàn)的問題:出現(xiàn)不連續(xù)的橫紋?？赡艿脑?樣品中含有干擾物質(zhì),比如鹽類,離子去污劑(SDS),肽類,核酸類(e.g.DNA, RNA),脂類,多糖和酚類化合物。推薦解決的方法:以下是我們針對不同雜質(zhì)推薦的不同去除方法。更詳細的信息請參閱Rabilloud （1996）.鹽：為確保IEF順利完成,樣品中的總鹽類不得超過40mM。樣品中的鹽類物質(zhì)可以通過透析,凝膠過濾,蛋白濃縮,或者蛋白沉淀后再復溶等方法減少或除去。蛋白質(zhì)沉淀可以選用10%TCA丙酮處理 （Damerval et al. 1986）,也可選用ReadyPrep 2-D cleanup kit。沉淀后，可以選用IEF/2-

12、D上樣緩沖液重新溶解蛋白樣品。注意在蛋白復溶前將沉淀試劑完全去除。陰離子去污劑：SDS是一種十分有效的去污劑，用于溶解難溶的蛋白。SDS可以迅速使樣品中的蛋白酶失活，并減少脂類物質(zhì)對IEF的影響。但是由于其強陰離子的特性會干擾一相等電聚焦，因此在樣品處理時就要注意其對樣品的影響。如果在樣品制備中使用SDS，那么在一相等電聚焦前，須用含有過量兼性離子或中性離子的溶液稀釋樣品以降低SDS的干擾。最終，樣品中SDS的含量須低于0.25% (w/v)，樣品中其他去污劑和SDS之比至少應大于8：1。如果前述方法不足以去除樣品中的SDS，那么可以將蛋白質(zhì)多步清洗后沉淀來清除SDS，并用前面所介紹去除鹽類物

13、質(zhì)的樣品緩沖液重新溶解蛋白質(zhì)。核酸：處理培養(yǎng)細胞和從組織中分離的細胞時，往往造成很高的蛋白/核酸比率。核酸物質(zhì)會增加樣品的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，從而阻止蛋白滲入膠條，并會緩慢遷移形成條帶。同時，核酸還會和蛋白通過離子間作用力結合，造成假遷移使2-D膠上出現(xiàn)橫紋。通常使用核酸內(nèi)切酶酶解核酸是最為直接的方法。在樣品中加入 0.1x solution containing 1 mg/ml DNase I, 0.25 mg/ml RNase A, and 50 mM MgCl2 而后冰浴 (Blomberg et al. 1995). 注意：Mg2+離子是DNase活性所必須的。多聚糖類：

14、同核酸一樣，高分子糖聚合物可能堵住膠孔從而影響IEF。此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所帶的負電荷能和蛋白質(zhì)作用，從而在2-D膠上形成橫條紋。建議通過TCA/丙酮沉淀(Damerval et al. 1986)；或者醋酸銨沉淀后酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986)；或者使用 ReadyPrep 2-D cleanup kit處理樣品。脂類：蛋白質(zhì)能和脂類通過疏水力互相作用，在2-D膠上造成假象。在水化液中，脂蛋白復合物可能完全不溶，也就不能滲進膠條中的聚丙烯酰氨凝膠中去。一個破壞脂-蛋白間作用力的方法就是提高去污劑的濃度有些樣品在復溶前, 須用有機溶劑破壞脂鍵，常用

15、的是甲醇和氯仿的混合物(Wessel and Flugge 1984)。酚類化合物：植物組織含有大量的酚類化合物，它們往往以氫鍵和蛋白質(zhì)相互強烈作用。這些化合物有可能通過酶的催化使蛋白氧化，形成共價鍵修飾蛋白。酚類化合物的影響，可以通過以下方法去除。1. 酚類化合物可以被polyvinylpyrrolidone (PVP) or polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)吸附。2. 樣品制備中加入DTT，抗壞血酸，亞硫酸鹽可以防止酚類氧化作用。3. 氧化酚類的酶可以被制備樣品時所用裂解液中的硫尿所抑制。4. 裂解的液氮凍存的樣品可以直接加入強變性劑混合物 如 TCA/丙酮

16、(Damerval et al. 1986).，可以抑制酚氧化。推薦產(chǎn)品:ReadyPrep 2-D cleanup kitBio-Spin/Micro Bio-Spin 6 columns出現(xiàn)的問題:膠部分出現(xiàn)橫紋?？赡艿脑?蛋白上樣量過高。推薦解決的方法：a）稀釋樣品，降低樣品濃度。在進行IEF前，須對樣品進行定量，以確保一相等電聚焦有合適的樣品濃度。蛋白上樣量須根據(jù)所選IPG膠條和染色方法而定。b）使用長IPG膠條，和更寬的PAGE膠可以增加蛋白樣品上樣量，詳細請見下表：IPG Strip Length7 cm11 cm17 cm18 cm24 cmRehydrationvolume

17、per strip125 l185 l300 l315 l410 lProtein loadSilver stain520 g2050 g5080 g5080 g80150 gSYPRO Ruby520 g2050 g5080 g5080 g80150 gCoomassieBlue G-25050100 g100200 g200400 g200400 g400800 gc）如果可能，可以減少樣品中的高豐度蛋白含量。例如在血清中，白蛋白占血清蛋白總量的70-90%。如果上樣蛋白中含有上述蛋白的話，將會掩蓋對其他蛋白的觀察。減少或除去樣品中的高豐度蛋白可以相對增加其他蛋白的含量，減少條紋，有利于對

18、低豐度蛋白的觀察。推薦產(chǎn)品：a) RC DC protein assayb) PROTEAN Plus (24 cm) or PROTEAN II (17 cm) precast gelsc) Aurum serum protein and Aurum Affi-Gel Blue mini kits 出現(xiàn)的問題:膠部分出現(xiàn)橫紋?？赡艿脑?蛋白上樣量過高。推薦解決的方法：a）稀釋樣品，降低樣品濃度。在進行IEF前，須對樣品進行定量，以確保一相等電聚焦有合適的樣品濃度。蛋白上樣量須根據(jù)所選IPG膠條和染色方法而定。b）使用長IPG膠條，和更寬的PAGE膠可以增加蛋白樣品上樣量，詳細請見下表：IP

19、G Strip Length7 cm11 cm17 cm18 cm24 cmRehydrationvolume per strip125 l185 l300 l315 l410 lProtein loadSilver stain520 g2050 g5080 g5080 g80150 gSYPRO Ruby520 g2050 g5080 g5080 g80150 gCoomassieBlue G-25050100 g100200 g200400 g200400 g400800 gc）如果可能，可以減少樣品中的高豐度蛋白含量。例如在血清中，白蛋白占血清蛋白總量的70-90%。如果上樣蛋白中含有上

20、述蛋白的話，將會掩蓋其他蛋白的觀察。去處樣品中的高豐度蛋白可以相對增加其他蛋白的含量，減少條紋，有利于低豐度蛋白的觀察。推薦產(chǎn)品：a) RC DC protein assayb) PROTEAN Plus (24 cm) or PROTEAN II (17 cm) precast gelsc) Aurum serum protein and Aurum Affi-Gel Blue mini kits 出現(xiàn)的問題:膠上出現(xiàn)橫條紋?？赡艿脑?IEF條件沒有優(yōu)化。推薦解決的方法： 通過一系列聚焦時間實驗，優(yōu)化聚焦時間程序。例如，可以在一個聚焦槽上，用同樣一個樣品走6根膠條，而后每隔一段時間取走一根

21、膠條(20 kV-hr, 30 kV-hr, 40 kV-hr, etc.)。 確保所有的樣品在同一個實驗條件下進行IEF，通常IEF聚焦時設置一個總電流。如果其中有一個樣品的導電性高于其他的樣品，那么電流大部分將經(jīng)過該膠條，而降低其他膠條的通過電流。因此不同導電性質(zhì)的樣品，應該分別進行IEF。 出現(xiàn)的問題:膠上出現(xiàn)橫條紋可能的原因:IEF條件沒有優(yōu)化。推薦解決的方法： 通過一系列聚焦時間實驗，優(yōu)化聚焦時間程序。例如，可以在一個聚焦槽上，用同樣一個樣品走6根膠條，而后每隔一段時間取走一根膠條(20 kV-hr, 30 kV-hr, 40 kV-hr, etc.)。 確保所有的樣品在同一個實驗條

22、件下進行IEF，通常IEF聚焦時設置一個總電流。如果其中有一個樣品的導電性高于其他的樣品，那么電流大部分將經(jīng)過該膠條，而降低其他膠條的通過電流。因此不同導電性質(zhì)的樣品，應該分別進行IEF。 推薦產(chǎn)品：PROTEAN IEF cellReadyStrip IPG strips出現(xiàn)的問題:在堿性端附近出現(xiàn)橫條紋?？赡艿脑?DTT含量不足，造成雙硫鍵被氧化。推薦解決的方法： 推薦解決的方法：在樣品進行等電聚焦前，用TBP/IAA烷基化還原樣品(Herbert et al. 2001). 在IEF中，必須解決堿性蛋白易在堿性環(huán)境中較易形成雙硫鍵的問題，而TBP/IAA可以防止雙硫鍵重新形成。通常而言

23、，樣品水化液和平衡緩沖液中的DTT是用于打開雙硫鍵并保持其還原狀態(tài)的。但是DTT在堿性中去質(zhì)子而帶負電，并可從堿性端遷移出IPG膠條而使蛋白質(zhì)中的硫醇鍵再氧化形成分子內(nèi)的雙硫鍵。為使實驗方便起見，BIO-RAD公司提供了ReadyPrep reduction-alkylation kit 以去除雙硫鍵。 為增加堿性蛋白的分離，可以在IPG水化液水化膠條后，采用在陽極端杯上樣的方法上樣。 推薦產(chǎn)品：ReadyPrep reduction-alkylation kitCup loading tray二、 垂直條紋出現(xiàn)的問題:在加樣電極一端出現(xiàn)垂直條紋?？赡艿脑?蛋白出現(xiàn)聚集或者沉淀。推薦解決的方

24、法： 稀釋樣品，在樣品進行IEF前須對樣品分析和定量，以確保正確的上樣量。樣品上樣量通常和IEF時所選用的IPG膠條的長度和染色方法有關。詳細請見下表： IPG Strip Length7 cm11 cm17 cm18 cm24 cmRehydrationvolume per strip125 l185 l300 l315 l410 lProtein loadSilver stain520 g2050 g5080 g5080 g80150 gSYPRO Ruby520 g2050 g5080 g5080 g80150 gCoomassieBlue G-25050100 g100200 g200

25、400 g200400 g400800 g 延長起始階段低電壓的時程，并逐步升壓。詳細見下表: StepVoltageTime1150 V3 hr2300 V1 hr3600 V1 hr41,200 V1 hr51,200 V10,000 Vlinear gradient1 hr610,000 Vsteady-state推薦產(chǎn)品：RC DC protein assayPROTEAN IEF cell 出現(xiàn)的問題:出現(xiàn)垂直的點狀條紋可能的原因:a) 平衡時間過短b) SDS-PAGE膠的pH值錯誤c) 在平衡液中，SDS的濃度過低。推薦解決的方法：a) 延長膠條平衡時間，如有必要，可以平衡多達3

26、0分鐘。b) 檢查制SDS-PAGE膠時所用Tris-HCl的pH是否8.8。如果Tris-HCl的pH錯誤，那么SDS-蛋白復合物的遷移速度就會降低，從而產(chǎn)生垂直的點狀條紋。c) 保證平衡液中的SDS濃度至少為2% (w/v)推薦產(chǎn)品：Bio-Rad precast gelsReadyPrep 2-D starter kit equilibration buffers I and IIResolving gel buffer (1.5 M Tris-HCl, pH 8.8)出現(xiàn)的問題:條紋沿膠的縱軸垂直分布?？赡艿脑?IPG膠條水化不充分，IPG水化液太少。推薦解決的方法： 確保所選擇IP

27、G膠條的相應水化液的用量正確。下表列出了不同長度膠條所需水化液的用量，但在實驗中要按操作手冊說明操作。 注意：如果IPG膠條的上樣水化液中已經(jīng)含蛋白樣品，那么上樣量不能超過所推薦的加樣量。另一方面，上樣量不足會使IPG膠條總蛋白上樣量不足。 IPG Strip Length7 cm11 cm17 cm18 cm24 cmRehydrationvolume per strip125 l185 l300 l315 l410 l 如果樣品僅僅部分潤濕膠條，蛋白樣品在膠條上就會分布不均勻。必須將聚膠槽中的膠條輕輕沿聚焦槽來回拖動幾次，以使樣品能完全潤濕整根IPG膠條。 推薦產(chǎn)品：ReadyStrip

28、IPG stripsReadyPrep 2-D starter kit rehydration/sample buffer 出現(xiàn)的問題:膠上出現(xiàn)了單獨垂直的空白條帶。可能的原因:在IPG膠條和SDS-PAGE膠界面含有氣泡推薦解決的方法： 確保第二相SDS-PAGE膠的頂部為一直線，從而使IPG膠條和SDS-PAGE膠面完全緊貼。 在IPG膠條加到SDS-PAGE膠面上后，應用瓊脂糖凝膠覆蓋，以免膠條滑動。盡量避免在覆蓋瓊脂糖時產(chǎn)生氣泡。通常使用的瓊脂糖濃度為0.5%或 1%。 使用前須完全溶解。 推薦產(chǎn)品：PROTEAN Plus overlay agarose (Catalog# 163-

29、2092)ReadyPrep overlay agarose (Catalog# 163-2111)三、 其它出現(xiàn)的問題:點彎曲。可能的原因:灌制SDS-PAGE膠時，沒有用覆蓋液（如水飽和正丁醇）。推薦解決的方法：在灌制SDS-PAGE膠后，須立即在膠面頂部加覆蓋液，如水飽和的(n-butanol, l-butanol, or t-butanol)。 水飽和正丁醇須純凈，并呈一直線平鋪于膠頂部。推薦產(chǎn)品：Bio-Rad precast gels出現(xiàn)的問題:膠的部分區(qū)域的點發(fā)生扭曲?？赡艿脑?SDS-PAGE沒有完全均勻地凝聚，電泳玻璃板沒有被卡緊。推薦解決的方法： 確保各配膠所需的試劑濃度正確，如TEMED，APS和其他試劑。TEMED和APS的終濃度均為0.05%,長度超過20cm的SDS-PAGE膠所須的TEMED的終濃度為0.025%。配膠所需的APS須新制，因為APS極易吸濕，在溶于水后就會分解，并會失活。因此，應當確保APS在使用前新鮮配制。 聚丙烯