1、,醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文答辯,研 究 生：XXX 導(dǎo) 師：XX教授,2020,MEDICAL THESIS DEFENSE,研究的背景及意義,材料與方法,實驗結(jié)果與討論,1,2,3,目錄,CONTENTS,總 結(jié),不足與展望,致 謝,4,5,6,第一部分 研究的背景及意義,PART 01,01,研究的背景及意義,對缺血性腦中風(fēng)發(fā)病機制及防治的研究已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點。,缺血大腦迅速獲得血液供應(yīng)是阻止缺血性神經(jīng)元損傷的首要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又進一步加重缺血組織的損傷-即缺血再灌注損傷。,氧化應(yīng)激和炎癥是缺血再灌注損傷病理生理機制的重要組成部分。腦缺血再灌注早期即有大量活性氧產(chǎn)生，并迅速啟動

2、損傷級聯(lián)，加劇了初始損害最終導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆的損傷。因此，再灌注早期阻斷氧化應(yīng)激損傷是有效降低遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵。,研究的背景及意義,那么，Genistein postconditioning(GPC，即缺血后給予Genistein)是否能通過eNOS/Nrf2/ARE信號通路降低氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮抗缺血性神經(jīng)元損傷的作用？目前尚未見報道。,本研究采用四動脈結(jié)扎(4-VO)全腦缺血模型，觀察GPC對缺血性神經(jīng)元的保護作用，并探討其可能的分子機制，為臨床防治缺血性腦中風(fēng)提供理論依據(jù)。,研究的背景及意義,第二部分 材料與方法,PART 02,02,大鼠腦立體定位儀 大鼠腦微量注射泵 冰凍切片機

3、 激光掃描共聚焦顯微鏡 酶標(biāo)儀 電泳設(shè)備 搖床 Morris水迷宮 超低溫冰箱等,組織裂解液 BCA蛋白濃度測定試劑盒 eNOS、p-eNOS、 Nrf2、HO-1一抗及其相應(yīng)的二抗 NBT/BCIP顯色液 NeuN、4-HNE、8-OHdG一抗及對應(yīng)的熒光二抗 TUNEL試劑盒,材料與方法,SPF級成年雄性SD大鼠,隨機分組及4-VO模型,材料與方法,再灌注5d檢測 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元 的凋亡及存活,實驗方法及檢測指標(biāo),再灌注30min, 6h,1d,3d 觀察 p-eNOS, Nrf2, HO-1蛋白表達,免疫熒光 染色法,蛋白免疫 印跡技術(shù),TUNEL染色 及NeuN染色,再灌注3d觀察

4、 海馬CA1區(qū)神 經(jīng)元8-OHdG, 4-HNE, Nrf2, HO-1蛋白的 表達及定位,Morris水迷宮,再灌注7-9d， 檢測大鼠的空間 學(xué)習(xí)和記憶能力,材料與方法,數(shù)據(jù)整理后，應(yīng)用SigmaStat3.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有計量資料數(shù)值以均數(shù)標(biāo)準差表示，采用單因素方差分析(ANOVA)，多個實驗組與一個對照組比較用最小顯著差法(LSD)，各實驗組之間比較采用q檢驗(Newman-keuls test)，P 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。,材料與方法,第三部分 實驗結(jié)果與討論,PART 03,03,圖1、 NeuN及TUNEL免疫熒光染色觀察再灌注5d大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的存活

5、及凋亡,A,B,C,實驗結(jié)果與討論,圖A：NeuN (紅色) 染色 ：生存的神經(jīng)元；TUNEL (綠色)染色：凋亡樣神經(jīng)元；圖B：海馬CA1區(qū)1mm 長度內(nèi)NeuN 陽性神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計圖；圖C：海馬CA1區(qū)1mm長度內(nèi) TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計圖; *P0.05 vs. I/R 組， #P0.05 vs. GPC 組，n=5; 40, bar = 50m,小結(jié) 1 Genistein后處理對缺血性神經(jīng)元損傷具有保護作用，eNOS激酶抑制劑L-NAME減弱了該作用，說明eNOS可能參與了此保護作用。,Genistein后處理是否誘導(dǎo)eNOS激活（磷酸化）?,實驗結(jié)果與討論,圖2 GPC對大鼠

6、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元eNOS、p-eNOS蛋白表達的影響,圖A：再灌注不同時間點p-eNOS、eNOS蛋白的表達；Sh：Sham組；R：再灌注；： I/R組；： GPC組；GPC: Genistein后處理；圖B： p-eNOS蛋白表達統(tǒng)計圖： n=4； *p0.05 vs. I/R組,A,B,實驗結(jié)果與討論,A,B,實驗結(jié)果與討論,圖3 L-NAME對再灌注3d大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元 eNOS磷酸化水平的影響,圖A：各實驗組再灌注3 d p-eNOS蛋白表達；圖B：各實驗組再灌注3 d p-eNOS蛋白表達統(tǒng)計圖，n=5，*p0.05 VS. I/R 組；#p0.05 VS. Vehicle2

7、 組,小結(jié) 2 Genistein后處理可誘導(dǎo)全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)eNOS磷酸化水平升高，eNOS激酶抑制劑L-NAME可有效降低GPC誘導(dǎo)的eNOS磷酸化水平。 結(jié)果揭示：eNOS磷酸化水平升高參與了Genistein的神經(jīng)保護作用。,Genistein后處理是否能有效降低缺血再灌注后神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷呢?,實驗結(jié)果與討論,圖4 全腦缺血再灌注3 d，各實驗組大鼠海馬CA1區(qū) 4-HNE及8-OHdG免疫熒光染色,A,圖A：綠色: NeuN； 紅色: 4-HNE； 圖B：紅色: DAPI； 綠色: 8-OHdG；n=4-5； 40； bar =50 m,實驗結(jié)果與討論,小結(jié) 3 GPC

8、能有效降低氧化應(yīng)激損傷；eNOS激酶抑制劑L-NAME廢除了此神經(jīng)保護作用。,Nrf2/ARE信號是生物體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)最重要的內(nèi)源性防御系統(tǒng)。那么，GPC是否通過eNOS誘導(dǎo)了此信號通路?,實驗結(jié)果與討論,C,圖5 A-C GPC促進大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2蛋白表達,圖A： 再灌注不同時間點核內(nèi)Nrf2蛋白表達；圖B：再灌注不同時間點核內(nèi)Nrf2蛋白表達統(tǒng)計圖，n=4，*p0.05 vs. I/R組；圖C：再灌注3d 各實驗組Nrf2 蛋白的表達及統(tǒng)計圖；*p0.001 vs. I/R組， #p0.001 vs.Vehicle2 組,A,實驗結(jié)果與討論,圖5 D 免疫熒光染色法觀察大鼠再灌

9、注3d海馬CA1區(qū) 神經(jīng)元內(nèi)Nrf2 的表達及定位,綠色：Nrf2 ；紅色: NeuN； 黃色：二者的共定位；40； bar =30m.,L-NAME,實驗結(jié)果與討論,圖6 大鼠再灌注3d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)HO-1蛋白表達及其與Nrf2的共定位,圖A-B： HO-1蛋白表達及其統(tǒng)計圖； 圖C： HO-1與Nrf2蛋白的共定位，*p0.05 VS. I/R 組； #p0.05 VS. vehicle2組；綠色：Nrf2； 紅色：HO-1；藍色：DAPI ；合成圖為三者的共定位； 40； n=4-5； bar = 50m；,實驗結(jié)果與討論,小結(jié) 4,實驗結(jié)果與討論,海馬是學(xué)習(xí)和記憶的重要部位，而

10、海馬CA1區(qū)是缺血最敏感的區(qū)域。那么，GPC是否能改善大鼠缺血后空間學(xué)習(xí)記憶能力?,GPC可顯著增加海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞核中Nrf2蛋白的表達并引起下游靶基因HO-1的表達，而L-NAME阻斷了此作用。 此結(jié)果進一步揭示GPC通過eNOS誘導(dǎo)了Nrf2/HO-1抗氧化信號通路，從而阻斷了缺血再灌注后遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。,圖7 GPC對大鼠缺血后空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響,圖A-B： 潛伏實驗和探索實驗統(tǒng)計圖；n=5；*p0.05 vs.I/R組；#p0.05 vs.GPC 組. 圖C-D： 潛伏實驗和探索實驗大鼠游泳路程軌跡圖,D,C,實驗結(jié)果與討論,小結(jié) 5 GPC能有效的改善大鼠缺血后的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。,實驗結(jié)果與討論,第四部分 總 結(jié),PART 04,04,總結(jié),第五部分 不足與展望,PART 05,05,不足與展望,第四部分 致 謝,PART 04,04,實驗和論文的最終完成是我的導(dǎo)師*教授精心指導(dǎo)的結(jié)果。謹借此機會，向我敬愛的恩師表示最衷心的感謝！ 感謝河北聯(lián)合大學(xué)研究生學(xué)院、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室以及形態(tài)中心的各位老師所給予我的指導(dǎo)、關(guān)心與包容！ 感謝在學(xué)習(xí)及生活中曾經(jīng)與我朝夕相處、共同努