1、人類基因組DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳分析,第一節(jié) 實驗目的,掌握人類基因組DNA提取的基本原理和方法,掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA方法,第二節(jié) 實驗原理,核酸提取思路：,破膜：細胞膜、核膜 分離：通過酶，有機溶劑，調節(jié)pH值，離心等 純化：去除雜質,DNA提取原則：,保證DNA一級結構的完整性 排除其他分子的污染，使其純度盡可能高 排除有機溶劑和金屬離子的污染 蛋白質、多糖、脂類等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染,樣品來源：,培養(yǎng)細胞 組織標本 血液樣本,用細胞裂解液裂解細胞膜，收集細胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并從DNA上解離下來，經(jīng)苯酚氯仿抽提去除蛋

2、白質，無水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗滌DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的DNA。,本次實驗使用的試劑盒系直接加入裂解液裂解細胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并從DNA上解離下來，再利用特殊硅基質膜吸附DNA的特性，可快速、高效地純化回收基因組DNA。,離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽，低pH值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的DNA，再通過漂洗液將雜質去除，最后低鹽，高pH值的洗脫緩沖液或去離子水將DNA從硅基質膜上洗脫。,高鹽，低pH值： 選擇性結合 DNA,漂洗,低鹽，高pH值： DNA從硅基質膜上洗脫,第三節(jié) 主要試劑,主要試劑,培養(yǎng)細胞 RNase A（100mg/ml）

3、Protease Buffer GR Buffer GL 無水乙醇 Buffer GW1 Buffer GW2 Buffer GE,第四節(jié) 主要儀器,微量移液器,臺式微量離心機,電泳儀,凝膠成像系統(tǒng),主要儀器,LIFE,第五節(jié) 操作步驟,.,14,1.樣品處理：取1管細胞，做好標記，5000rpm離心3分鐘，棄上清，收集細胞。,3.向以上溶液中加入20 l Protease K，混勻。,4.加入200 l Buffer GL，顛倒混勻15次，劇烈震蕩至少1分鐘。 注意：不要直接將Protease直接加入到Buffer GL。,5. 56孵育10分鐘，其間顛倒混勻數(shù)次,6.加入200 l無水乙醇

4、，顛倒混勻10次，劇烈震蕩。短暫離心，使管壁和壁蓋上 的液體集中到管底。,第五節(jié),操作步驟,7.將步驟5所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱中，一次不能加完溶液，可分多次轉入。12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，吸附柱重新放回收集管中。,2.加入200l GR，用移液器反復吸打幾次，使細胞懸浮。,.,15,10.吸附柱置于一個新的離心管中，向吸附柱中間部位懸空加入60l Buffer GE， 室溫放置2分鐘，12,000 rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20保存DNA。,7.向吸附柱中加入500 l Buffer GW1，12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的 廢液

5、，將吸附柱重新放回收集管中。,8.向吸附柱中加入500 l Buffer GW2，12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的 廢液，將吸附柱重新放回收集管中。,9.10,000 rpm離心2分鐘，倒收集管中的廢液。吸附柱置室溫2分鐘，以徹底晾干。,第五節(jié),操作步驟,11.取5 -10l基因組DNA，并加入2 l上樣緩沖液，混勻，加樣到1瓊脂糖凝膠點樣孔中，電泳檢測分析。,第六節(jié) 注意事項,.,17,（1）試劑配制及保存規(guī)范，離心管及Tip頭需經(jīng)高壓滅菌處理。,（2）基因組DNA長而彎曲，易斷裂。操作過程中盡量輕緩，避免過度的 溶液吹打轉移，以及過高的溫度。,第六節(jié),注意事項,第七節(jié) 結果分

6、析,.,19,第七節(jié),結果分析,量：越多越好。量越多電泳區(qū)帶越明亮。 質量： a. 純度越純越好。A260/A280越接近1.8越好 b. 分子量越大越好。 DNA分子量大于30KB，可滿足一般實驗要求。1.0的瓊脂糖凝膠電泳，理想電泳結果:靠近點樣孔，落后于Marker最后一條區(qū)帶(約21KB)的位置可見一條明亮的區(qū)帶。區(qū)帶前方，不應有拖尾（降解），或較彌散的小分子量區(qū)帶（RNA）。,.,20,M: DNA/HindIII+EcoRI DNA Marker； 1-5: 基因組DNA 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳結果圖,第七節(jié),結果分析,LIFE,課程相關資源,課程簡介,課程簡介,醫(yī)學分子生物學-國家精品資源共享