1、有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)進(jìn)展,報(bào)告內(nèi)容,一. 有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)概況 二.中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)現(xiàn)狀及成就 三. 中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵研究進(jìn)展舉例 丙酸發(fā)酵 -酮戊二酸發(fā)酵 四. 中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)展望,一、有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)概況,有機(jī)酸概述,有機(jī)酸是指一些具有酸性的有機(jī)化合物。最常見的有機(jī)酸是羧酸，其酸性源于羧基(-COOH),Various substances that can be derived from succinic acid by chemical conversion.,Trends in Biotechnology , 2008:100 - 108,有機(jī)酸概述,有機(jī)酸也是重要的平臺(tái)化合物,Renew

2、able raw materials,全球有機(jī)酸的產(chǎn)量超過(guò)300萬(wàn)噸、產(chǎn)值超過(guò)50億美元,檸檬酸,乳酸,蘋果酸,葡萄糖酸,醋酸,衣康酸,曲酸,丙酮酸,酒石酸,丙酸,C2,C3,C4,C5,C6,丙烯酸,富馬酸,酒石酸,有機(jī)酸發(fā)酵概況,二、中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)現(xiàn)狀及成就,中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)現(xiàn)狀,有機(jī)酸工業(yè)是發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域一個(gè)成熟的分支。 2012年中國(guó)有機(jī)酸的總產(chǎn)量超過(guò)200萬(wàn)噸。,檸檬酸,乳酸,蘋果酸,葡萄糖酸,醋酸,衣康酸,曲酸,丙酮酸,食品和飲料,醫(yī)藥工業(yè),化學(xué)工業(yè),建筑業(yè),例如：酸味劑,例如：抗凝血?jiǎng)?例如：洗滌劑,例如：混泥土,日照魯信金禾生化有限公司,安徽豐原集團(tuán),河南金丹乳酸科技股份有

3、限公司,濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司,山東檸檬生化有限公司,宜興協(xié)聯(lián)生物化學(xué)有限公司,杭州寶晶生物化工有限公司,青島科海生物有限公司,天富生化技術(shù)有限責(zé)任公司,西王集團(tuán),主要生產(chǎn)企業(yè),產(chǎn)品,應(yīng)用領(lǐng)域,沈陽(yáng)科納提克公司,酒石酸,其他工業(yè),例如：顯影劑,琥珀酸,安徽雪郎生物科技股份有限公司,丙酸,中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)成就,(1) 自主創(chuàng)新能力顯著增強(qiáng),研發(fā)投入加大：企業(yè)研發(fā)投入約占銷售收入的3-5%。,研究平臺(tái),衣康酸：2000年獲國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。,長(zhǎng)鏈二元酸：2006年獲國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。,丙酮酸：2006年獲國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。,L-乳酸：2011年獲國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。,“丙酮酸發(fā)酵技術(shù)”被世界

4、上最大發(fā)酵公司之一日本味之素公司購(gòu)買，成為該公司從中國(guó)購(gòu)買的第一個(gè)技術(shù)。,中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)成就,(2) 產(chǎn)品產(chǎn)量迅速提高、產(chǎn)品結(jié)構(gòu)更趨合理,近20年，我國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)主要產(chǎn)品的總產(chǎn)量呈快速增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。產(chǎn)品品種從早期2-3個(gè)發(fā)展到10余個(gè)。,近20年有機(jī)酸主要產(chǎn)品產(chǎn)量,單位：萬(wàn)噸,中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)成就,(3) 生產(chǎn)技術(shù)水平不斷上升（以檸檬酸為例）,有機(jī)酸行業(yè)龍頭近年來(lái)紛紛通過(guò)擴(kuò)大優(yōu)勢(shì)產(chǎn)品的產(chǎn)能，提高抗風(fēng)險(xiǎn)能力，使得行業(yè)產(chǎn)業(yè)集中度呈現(xiàn)逐步提高態(tài)勢(shì)，規(guī)模經(jīng)濟(jì)效應(yīng)也使行業(yè)平均期間費(fèi)用率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這有利于保障行業(yè)的盈利能力提升與長(zhǎng)期發(fā)展。,中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)成就,(4) 企業(yè)規(guī)模擴(kuò)大，產(chǎn)業(yè)集

5、中度增強(qiáng),我國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵行業(yè)產(chǎn)業(yè)集中度,中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵工業(yè)成就,(5)新技術(shù)、新材料和新裝備得到廣泛應(yīng)用,酶技術(shù)、膜技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)越來(lái)越多的被采用,設(shè)備趨于大型化、連續(xù)化和自動(dòng)化,三. 中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵研究進(jìn)展丙酸,丙酸的應(yīng)用及市場(chǎng),2012: 260m lbs (117,936 tonnes),化學(xué)法：2萬(wàn)/噸,發(fā)酵法：6萬(wàn)/噸（食品安全）,丙酸鈣價(jià)格,06年全球產(chǎn)量37.7萬(wàn)噸,75%用于谷物 和飼料防腐,篩選丙酸高產(chǎn)菌,菌種鑒定,篩選野生型質(zhì)粒,細(xì)胞壁裂解條件優(yōu)化,條件: 溶菌酶 20 mg/mL 37 oC, 蛋白酶K 2 mg/mL 56 oC. “-” 表示細(xì)胞壁沒有裂解. “+”

6、 表示細(xì)胞壁被裂解.,質(zhì)粒電泳圖,質(zhì)粒鑒定分析,質(zhì)粒ORF轉(zhuǎn)錄水平分析,丙酸高產(chǎn)菌、野生質(zhì)粒的篩選以及質(zhì)粒分析,丙酸桿菌代謝工程改造策略,過(guò)量表達(dá)甘油脫氫酶（gldA），提高對(duì)甘油的利用速率 過(guò)量表達(dá)蘋果酸脫氫酶（mdh），富馬酸水合酶（fumC），提高丙酸代謝途徑通量,gldA,mdh,fumC,過(guò)量表達(dá)甘油脫氫酶,野生菌與工程菌分批發(fā)酵對(duì)比 : 丙酸(PA), : 甘油濃度, : 細(xì)胞干重(DCW), : 乙酸(AA), : 琥珀酸 (SA), : 甘油脫氫酶比酶活.,培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化,不同種類的碳源對(duì)丙酸發(fā)酵過(guò)程的影響,不同種類的氮源對(duì)丙酸發(fā)酵過(guò)程的影響,酵母粉濃度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響,

7、PA,DCW,PA,DCW,SA,最佳碳源為20 g/L甘油，最佳氮源為酵母粉，最適濃度為10 g/L。 最佳接種量為10%，最佳接種齡為48-60h左右種子，最佳培養(yǎng)溫度為30 。,MgSO4 7H2O (mg/L),DCW(g/L),SA (g/L),PA (g/L),金屬M(fèi)g2+對(duì)發(fā)酵過(guò)程影響,金屬Co2+對(duì)發(fā)酵過(guò)程影響,ZnSO4 7H2O (mg/L),金屬Zn2+對(duì)發(fā)酵過(guò)程影響,金屬M(fèi)n2+對(duì)發(fā)酵過(guò)程影響,培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化-金屬離子,最佳Co2+濃度為10 mg/L,發(fā)酵模式研究-分批發(fā)酵,分批發(fā)酵過(guò)程中，隨著甘油濃度的增加，菌體比生長(zhǎng)速率及丙酸的比合成速率顯著下降，說(shuō)明較高的

8、甘油濃度不利于菌體生長(zhǎng)及丙酸的合成。,發(fā)酵模式研究-分批發(fā)酵,不同甘油濃度下過(guò)程動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較,隨著初始甘油濃度的增加，發(fā)酵時(shí)間明顯延長(zhǎng)，生產(chǎn)強(qiáng)度顯著下降；菌體干重先升高后降低；初始甘油濃度在20 g/L50 g/L時(shí)適合菌體生長(zhǎng)。,僅通過(guò)分批發(fā)酵難以實(shí)現(xiàn)丙酸 發(fā)酵高產(chǎn)量、高得率和高生產(chǎn)強(qiáng)度的統(tǒng)一,發(fā)酵模式研究-流加發(fā)酵,注：A 初始甘油濃度為20 g/L，48 h-96 h恒速流加濃度為400 g/L的甘油水溶液，流速控制為0.01 L/h；B 初始甘油濃度為30 g/L，72 h-120 h恒速流加濃度為400 g/L的甘油水溶液，流速控制為0.01 L/h；C 初始甘油濃度為50 g/L

9、，在96 h時(shí)一次性添加質(zhì)量為80 g的純甘油；D 初始甘油濃度為40 g/L，在84 h一次性添加160g純甘油； residual glycerol, PA, DCW, SA, * AA,不同流加發(fā)酵模式下過(guò)程動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較,發(fā)酵模式研究-流加發(fā)酵,最佳流加策略：初始甘油為30g/L，72-120h進(jìn)行 恒速流加，流加速率為0.11L/h(甘油濃度為400 g/L),發(fā)酵模式研究- 10m3發(fā)酵罐放大試驗(yàn),丙酸10 m3罐中試發(fā)酵過(guò)程曲線, residual glycerol, PA, DCW, SA, * AA,丙酸最高產(chǎn)量為47.28 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.197 gL-1h-1 全球

10、第二家采用發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸,三. 中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵研究進(jìn)展-酮戊二酸, -酮戊二酸的應(yīng)用,降低病患機(jī)體損耗,清除自由基，延緩衰老,提高繁殖率，促進(jìn)骨骼的生長(zhǎng),有機(jī)中間體,體格增強(qiáng)劑、運(yùn)動(dòng)飲料添加劑,醫(yī)藥,化妝品,食品,化工,飼料, -酮戊二酸市場(chǎng)概況,國(guó)際市場(chǎng)食品級(jí)-酮戊二酸潛在市場(chǎng)容量約為1萬(wàn)噸,化學(xué)法,發(fā)酵法,篩選得到的菌種：解脂亞諾酵母, -酮戊二酸的生產(chǎn)方法,生產(chǎn)效率低、環(huán)境非友好和有毒試劑使用，限制其在醫(yī)藥、保健品和食品等高附加值產(chǎn)品生產(chǎn)應(yīng)用,生產(chǎn)效率高 環(huán)境友好 食品安全性高,食品安全級(jí)生物法生產(chǎn)-酮戊二酸,土壤樣品,維生素B1缺陷型篩選,500株微生物菌株,0.1 g/L 13.4%

11、,0.1-1 g/L 74.4%,1-10 g/L 6.4%,10 g/L 5.8%,菌落形態(tài),AGTCTAGTATAAACAATTATACAGTGAAACTGCGAACGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTTTCTACATGGATAACCGTGATAACTTCAGAACTAATACATGACAGCCTTCTGGCGTATATATTAGATACAAACCAACAGTATGGTGATTCATAATATCTTGTCGAACCGATCTTCGGTGTATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTAGGATCGTGGCCTACCATGGTAAC

12、AACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCTATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATATATAACGATCCGGGGCTCTTTGAGTTTCGGAATTGGAATGAGTACAATTTAAACACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTG,18S rRNA,Yarrowia lipolytica WSH-Z06,生物法生產(chǎn)-酮戊二酸的關(guān)鍵問(wèn)題,當(dāng)以甘油為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵6天后-KG產(chǎn)量可達(dá)30 g/L左右，但是發(fā)酵液

13、中同時(shí)會(huì)積累大量的副產(chǎn)物丙酮酸(30 g/L左右)。,Y. lipolytica WSH-Z06搖瓶發(fā)酵曲線 -KG (), Glycerol (), Pyruvate (), DCW (),存在的問(wèn)題,1.輔因子調(diào)控,3.節(jié)流,2.開源,4.調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,解決方案代謝工程改造解脂亞洛酵母,代謝工程改造解脂亞洛酵母,1.輔因子調(diào)控,調(diào)控乙酰輔酶A代謝促進(jìn)-酮戊二酸的積累,過(guò)量表達(dá)ACS1基因使胞內(nèi)ACS比酶活達(dá)到0.92 U/mg protein，過(guò)量表達(dá)ACL基因使胞內(nèi)ACL酶活達(dá)到了1.51 U/mg protein，比對(duì)照分別提高了10.5和11.6倍，胞內(nèi)乙酰輔酶A含量分別是對(duì)照的23

14、1.2% 和244.2%。,調(diào)控乙酰輔酶A代謝促進(jìn)-酮戊二酸的積累,過(guò)量表達(dá)ACS1和ACL基因?qū)w生長(zhǎng)和-酮戊二酸合成的影響,: -KG; : Glycerol; : pyruvate; : DCW,(A): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-CON; (B): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-ACS1; (C): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-ACL.,提高16.2%,提高28.6%,Y

15、. lipolytica-ACS1和Y. lipolytica-ACL中-酮戊二酸的產(chǎn)量分別為42.2 g/L和46.7 g/L，比對(duì)照菌(36.3 g/L)分別提高了16.2%和28.6%。丙酮酸產(chǎn)量分別為14.5g/L和10.6 g/L，比對(duì)照菌(21.2 g/L)分別降低了31.6%和50%。,代謝工程改造解脂亞洛酵母,2.開源,強(qiáng)化丙酮酸羧化途徑促進(jìn)-酮戊二酸的積累,6.5倍,10.2倍,表達(dá)載體p0(hph)-ScPYC1和 p0(hph)-RoPYC2的構(gòu)建,Y. lipolytica及其突變株胞內(nèi)PC 酶活,轉(zhuǎn)化子提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證,強(qiáng)化丙酮酸羧化途徑促進(jìn)-酮戊二酸的積累,

16、過(guò)量表達(dá)ScPYC1和RoPYC2基因?qū)w生長(zhǎng)和-酮戊二酸合成的影響,: -KG; : Glycerol; : Pyruvate; : DCW,(A): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-CON; (B): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-ScPYC1; (C): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-RoPYC2.,Y. lipolytica-ScPYC1和Y. lipolytica-RoPYC2

17、中-酮戊二酸的產(chǎn)量分別為45.2 g/L和49.1 g/L，比對(duì)照菌(36.3 g/L)分別提高了24.5%和35.3%。丙酮酸產(chǎn)量分別為10.2 g/L和6.4 g/L，比對(duì)照菌(21.2 g/L)分別降低了51.9%和69.8%。,提高24.5%,提高35.3%,5 M3中試結(jié)果,Time course of fed-batch fermentation by constant feeding strategy in pilot scale,發(fā)酵156 h，PA：24.6 g/L； -KG ： 64.2 g/L,四. 中國(guó)有機(jī)酸發(fā)酵技術(shù)展望,技術(shù)發(fā)展1：基于組學(xué)分析構(gòu)建獲得優(yōu)良菌種,工業(yè)微生物基因組,組學(xué)分析,計(jì)算模擬,分子改造,新一代工業(yè)菌種,基因組,轉(zhuǎn)錄組,蛋白質(zhì)組,代謝組,結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì),途徑設(shè)計(jì),網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì),數(shù)據(jù)集成,基因組 理性設(shè)計(jì),基因組 網(wǎng)絡(luò)重構(gòu),全局?jǐn)_動(dòng) 優(yōu)化,多位點(diǎn) 快速進(jìn)化,基因組 刪減優(yōu)化,代謝途徑 優(yōu)化,技術(shù)發(fā)展2：發(fā)展信息和控制技術(shù)提高裝備水平,發(fā)酵過(guò)程