1、,姓名：張瑞玲 學(xué)號：20159147 專業(yè)：藥物化學(xué) 課程：免疫基礎(chǔ)原理,第七章 抗原與抗體相互作用,第一節(jié)：抗原抗體反應(yīng)特點,階段性,第一節(jié) 抗原與抗體反應(yīng)的特點,一、特異性 抗原與抗體相互結(jié)合只局限于一些大分子表面的特定部位，即抗原決定簇和抗體結(jié)合位點之間，且以親和力的作用方式結(jié)合在一起?？乖贵w的結(jié)合并沒有共價鍵形成，而是由這些特定部位之間的短程分子力相互作用的結(jié)果。這些吸引力只有在極短的距離內(nèi)才有效。因此抗原決定簇與抗體結(jié)合位點在空間上必須處于緊密接觸狀態(tài)，才能產(chǎn)生足夠的結(jié)合力。這種分子間的互補結(jié)構(gòu)決定了抗原抗體結(jié)合的專一性。,抗原抗體分子間的作用力.,抗原抗體交叉反應(yīng),抗原抗體專一

2、性反應(yīng),交叉反應(yīng),無反應(yīng),二、抗原與抗體結(jié)合的可逆性,抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)是一個可逆的反應(yīng) Ab+Ag Ab:Ag 可逆性指復(fù)合物在一定條件下可發(fā)生解離，恢復(fù)抗原抗體的游離狀態(tài)?？乖贵w結(jié)合是分子表面的結(jié)合。 影響因素： a.抗體對相應(yīng)抗原的親合力親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離 b.環(huán)境因素對復(fù)合物的影響:pH、離子強度 應(yīng)用：由于抗原抗體結(jié)合的可逆性，可利用親和層析法分離純化抗原或抗體；利用待測抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原與抗體的競爭結(jié)合，進(jìn)行抗原或抗體的定量測定，如放免檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法等,三、抗原與抗體反應(yīng)中量的 關(guān)系eg沉淀反應(yīng),抗體過量,平衡點,抗原過量,抗體,抗原,前帶,后帶,抗 原 抗

3、體 沉 淀 量,抗體一定抗原增加,前帶(prezone)：抗體過量 后帶(postzone)：抗原過量 等價帶(equivalence zone)： 抗原抗體比例合適,抗原與抗體反應(yīng)中量的關(guān)系,比例性（proportionality） 是指抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需要一定的量比關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時，才形成較大的抗原抗體結(jié)合物。以沉淀反應(yīng)為例，在加入固定量抗體的一排試管中，再依次加入一定量的遞增濃度的抗原進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著抗原濃度的增加，沉淀很快出現(xiàn)，但抗原超過一定范圍之后，沉淀速度和沉淀量隨抗原濃度增加反而降低，甚至到最后不出現(xiàn)沉淀， 沉淀反應(yīng)的速度反映了參加反應(yīng)的抗原和抗體濃度的

4、適合程度，適合程度高反應(yīng)快，反之則慢。通常把最迅速出現(xiàn)可見反應(yīng)時的抗原抗體的濃度比或量比稱為抗原抗體反應(yīng)的最適比（optimal ratio）或稱等價點（equivalence point）?？乖c抗體比例最合適的范圍稱等價帶（equivalencezone）。在最適比反應(yīng)條件下，抗原抗體幾乎全部結(jié)合成復(fù)合物，上清液中基本無游離的抗原和抗體。當(dāng)抗原和抗體濃度比超過此范圍時，可見反應(yīng)的速度和復(fù)合物的量都會迅速降低，甚至不可見，上清液中可測出游離的抗原或抗體。因抗原抗體比例不合適而不出現(xiàn)可見反應(yīng)，稱帶現(xiàn)象（zone phenomenon）。如果抗體過量時，稱為前帶（prozone）；抗原過量時，稱

5、為后帶（postzone）。在同一抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)中，不管抗原和抗體濃度如何變化，其沉淀反應(yīng)的最適比始終恒定不變， Marrack提出的網(wǎng)格學(xué)說解釋了抗原抗體反應(yīng)比例性的機制。天然抗原大多是多價的，抗體至少為兩價，當(dāng)抗原與抗體在等價帶結(jié)合時，相互交叉連接成具有立體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格狀復(fù)合體，形成肉眼可見的沉淀物。當(dāng)抗原或抗體過剩時，由于過剩方的結(jié)合價得不到飽和，只能形成較小復(fù)合物，并存在有較多游離的抗原或抗體，不能出現(xiàn)可見反應(yīng)。但是，當(dāng)抗原或抗體為單價，不管抗原與抗體的量比關(guān)系是否合適，均不能出現(xiàn)可見反應(yīng)現(xiàn)象。,三、抗原與抗體反應(yīng)的階段性,當(dāng)抗體與抗原結(jié)合時，如果是顆粒抗原，則出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；如果是可溶

6、性抗原，則產(chǎn)生沉淀作用，是抗原抗體反應(yīng)的繼發(fā)過程。 當(dāng)抗原與同型抗體相遇時，在合適條件下，不論彼此量的多少，都立即發(fā)生特異性的結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這一過程通常只需要幾秒的時間便可完成，稱為反應(yīng)的一級階段。,三、抗原與抗體反應(yīng)的階段性,在一級階段之后，繼發(fā)出現(xiàn)抗原與抗體間進(jìn)一步交聯(lián)而形成網(wǎng)絡(luò)狀凝集物，進(jìn)而出現(xiàn)可見的凝集和沉淀，稱為反應(yīng)的二級階段。 二級階段是抗原抗體網(wǎng)格生長的階段，速率要慢的多。 影響因素：很大程度上依賴于溫度、離子強度等外界條件，但更重要的是需要合適的抗原抗體分子比例。 只有當(dāng)二者的結(jié)合價彼此飽和時，才能連接成一個大網(wǎng)格樣凝集物，出現(xiàn)凝集或沉淀。,抗原抗體凝集（沉淀）反應(yīng)形

7、成的條件：,1、抗原結(jié)合價必須在2價以上； 2、抗體結(jié)合價也必須是2價或2價以上； 3、抗原抗體能形成復(fù)合物但不一定能形成沉淀； 4、抗原抗體結(jié)合形成大分子凝集物的前提是要求其結(jié)合價彼此飽和； 5、當(dāng)抗原大大過量時，只有溶解狀態(tài)的抗原抗體復(fù)合物，而無沉淀出現(xiàn)，在免疫檢測中稱為前帶現(xiàn)象。,第二節(jié) 影響抗原抗體反應(yīng)的因素,一、反應(yīng)物自身因素,抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目 1、抗原 抗原的理化性狀、抗原決定簇的數(shù)目和種類均可影響血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果 例如，可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)沉淀，而顆粒性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)則出現(xiàn)凝集;單價抗原與抗體結(jié)合不出現(xiàn)可見反應(yīng);粗糙型細(xì)菌在生理鹽水中易出現(xiàn)自凝；紅細(xì)胞與I

8、gG類抗體結(jié)合不出現(xiàn)直接凝集等。,反應(yīng)物自身因素,抗體:來源、特異性、親和性、效價 2、抗體 抗體是血清學(xué)反應(yīng)中的關(guān)鍵因素，對反應(yīng)的影響表現(xiàn)在以下三個方面: (1)來源:來自不同動物的免疫血清，其反應(yīng)性有差異。家兔等大多數(shù)動物的免疫血清具有較寬的等價帶，通常在抗原過量時才易出現(xiàn)可溶性免疫復(fù)合物;馬等大動物和人的免疫血清等價帶較窄，少量的抗原或抗體過剩，均可形成可溶性免疫復(fù)合物;家禽免疫血清不能結(jié)合哺乳動物的補體，并且在高鹽濃度（80g/L NaCl溶液中沉淀現(xiàn)象明顯。單克隆抗體一般不適用于沉淀反應(yīng)或凝集反應(yīng) (2)特異性與親和力 特異性和親和力是影響血清學(xué)反應(yīng)的兩個關(guān)鍵因素，它們共同影響試驗結(jié)

9、果的準(zhǔn)確程度。免疫動物早期獲得的抗血清特異性較好，但親和力低;后期獲得的抗血清一般親和力較高，但長期免疫易使免疫血清中抗體的類型和反應(yīng)性變得更為復(fù)雜。因此，用于診斷的試劑必須盡量選用特異性高、親和力強的抗體，才能保證和提高試驗結(jié)果的可靠性。,（3）濃度:,抗體的濃度往往是與抗原相對而言。合適的濃度才出現(xiàn)明顯的反應(yīng)現(xiàn)象。因此許多試驗應(yīng)進(jìn)行抗體預(yù)滴定，找出最適反應(yīng)濃度。,二、環(huán)境因素,電解質(zhì): 生理鹽水或緩沖液 酸堿度: pH6pH9 溫 度: 1540，37最適,1.電解質(zhì),抗原抗體結(jié)合后由親水性變?yōu)槭杷裕藭r易受電解質(zhì)影響，如有適當(dāng)濃度電解質(zhì)存在，就會使抗原抗體失去一部分電荷而相互凝集或沉淀

10、，出現(xiàn)可見反應(yīng);若無電解質(zhì)存在，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。通常在血清學(xué)試驗中，以85g/LNaCl溶液作為抗原抗體的稀釋液及反應(yīng)液，其中Na+和Cl-可分別中和膠體顆粒上的電荷，使膠體顆粒的電勢下降，形成可見的沉淀物或凝集物。但如果電解質(zhì)濃度過高，則會出現(xiàn)非特異性蛋白質(zhì)沉淀，即鹽析。 補體參與的溶細(xì)胞反應(yīng)，除需要等滲的NaCl溶液外，還需適雖的Mg2+和Ca2+離子參與。,2.酸堿度,合適的pH是抗原抗體反應(yīng)的必要條件之一。血清學(xué)試驗一般以pH6-9為宜，超出此范圍可影響抗原和抗體的理化性質(zhì)，導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。當(dāng)pH為3左右時，接近細(xì)菌抗原的等電點，可出現(xiàn)非特異性酸凝集，造成假象。,3.溫度,抗

11、原抗體反應(yīng)一般在15一40范圍內(nèi)均可進(jìn)行，最適溫度為37。在此范圍內(nèi)溫度越高，分子運動速度加快，增加抗原抗體接觸機會，反應(yīng)速度越快，但亦容易引起復(fù)合物解離;溫度越低，反應(yīng)速度緩慢，但抗原抗體結(jié)合牢固，易于觀察。某些特殊的抗原抗體反應(yīng)需要特定的溫度，如冷凝集素在4時與紅細(xì)胞結(jié)合，20以上反而解離。,T,4、作用時間,抗原抗體反應(yīng)應(yīng)有足夠的時間，不同反應(yīng)時間不同,此外，抗原抗體反應(yīng)在液相中反應(yīng)時，適當(dāng)振蕩與攪拌，也可促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)。,第三節(jié)：主要的抗原抗體反應(yīng)類型,免疫電泳,對流免疫電泳,對流免疫電泳,第三節(jié) 抗原與抗體反應(yīng)-免疫檢測法,抗原與抗體結(jié)合后，只有出現(xiàn)可見的反應(yīng)，如凝

12、集、溶血、沉淀實驗等，或用熒光素、酶、放射性同位素等標(biāo)記方法提高可測性，才便于在免疫檢測中運用?？梢娦苑磻?yīng)的出現(xiàn)，對抗原抗體分子合適比例的要求遠(yuǎn)比對彼此絕對量方面要高得多。這就是說，一方面在進(jìn)行免疫檢測時要注意抗原抗體的用量；另一方面只要提高可見度或可測性，便可大大提高免疫檢測方法的靈敏度。,一、凝集反應(yīng)（Agglutination),凝集反應(yīng)是指顆?？乖?凝集原)與相應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)的可見性現(xiàn)象。顆?？乖缤暾募?xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。 抗原稱為凝集原(agglutinogen)?？贵w稱為凝集素（agglutinin),二、沉淀反應(yīng),當(dāng)抗原是可溶性分子時，與抗

13、體結(jié)合則形成沉淀。 1、絮狀沉淀反應(yīng) 一系列試管中加入等量的抗體和遞增量的抗原，在中性條件下37度保溫1-2h，便可見到絮狀的沉淀?？捎糜趯ふ铱乖贵w反應(yīng)的合適比例，檢測抗原抗體的分子比。,尋找抗原抗體反應(yīng)的合適比例,2、環(huán)狀沉淀反應(yīng),在試管中加入抗體后，小心加入相應(yīng)抗原，使抗原抗體步混合，37度保溫10-20min，在二者界面上出現(xiàn)環(huán)狀沉淀。不能用于定量測定。 該試驗主要用于鑒定微量抗原， 如法醫(yī)學(xué)中鑒定血跡， 流行病學(xué)用于檢查媒介昆蟲體內(nèi) 的微量抗原等， 因該技術(shù)敏感度低，且不能作兩種以上抗原的分析鑒別，現(xiàn)已少用。,3、雙向擴散試驗,在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U散，在最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽?/p>

14、原抗體沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對比關(guān)系，可作出對抗原或抗體的定性分析。 沉淀線如靠近抗原孔，則指示抗體含量較大； 靠近抗體孔，則指示著抗原含量較多； 不出現(xiàn)沉淀線則表明抗體或抗原過剩； 另外，如出現(xiàn)多條沉淀線，則說明抗原和抗體皆不是單一的成分。因此，可用于鑒定抗原或抗體的純度。 當(dāng)抗原、抗體存在多種體系時，會出現(xiàn)多條沉淀弧。,雙向擴散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔. 中心孔滴抗原，外周孔滴抗體,用于測定抗體效價 。 中心孔滴抗體，外周孔滴抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。,抗原抗體為單一體系濃度不同,抗原抗體為單一體系時，抗原

15、濃度不同，沉淀弧的特征不同： 抗原抗體為多體系時，出現(xiàn)的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。,右,兩種受檢抗原（Ag-1,3.Ag1）有相同表位，形成一個完全融合的沉淀線抗體為雙價，兩種抗原完全不同（Ag-1和Ag-24）抗體為雙價，兩種抗原（Ag-1和Ag-12）皆有相同的1表位，又有不同的2表位，所以沉淀線呈部分融合的形狀。這種技術(shù)作為抗原的分析，是目前免疫化學(xué)中最常用的鑒定技術(shù)之一。,。,4、單向免疫擴散,：又稱單向瓊脂擴散，是定量抗原的一種檢測方法。與雙向擴散不同的是在瓊脂中含有一定量的抗體，孔內(nèi)加入未知量的相應(yīng)抗原。在37度保溫過程中，孔內(nèi)的抗原向周圍擴散，與抗體形成沉淀圈。根據(jù)沉淀圈的大小

16、確定抗原的含量,5、免疫電泳技術(shù),A、免疫電泳,免疫電泳為區(qū)帶電泳與免疫雙向擴散的結(jié)合，是由Grabar和Williams（1953）首先報道的。 先利用區(qū)帶電泳技術(shù)將不同電荷和分子量的蛋白抗原在瓊脂內(nèi)分離開，然后與電泳方向平行在兩側(cè)開槽，加入抗血清。置室溫或37使兩者擴散，各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)位置與抗體反應(yīng)形成弧形沉淀線,B、對流免疫電泳,對流免疫電泳實質(zhì)上是定向加速度的免疫雙擴散技術(shù)，其基本原理是：在瓊脂板上打兩排孔，一側(cè)各孔加入待測抗原，一側(cè)孔內(nèi)放入相應(yīng)抗體，抗原在陰極側(cè)，抗體在陽極側(cè)。通電后，帶負(fù)電荷的抗原泳向陽極抗體側(cè)，而抗體藉電滲作用流向陰極抗原側(cè)，在兩者之間或抗體的另一側(cè)（抗原過量時

17、）形成沉淀線。,C、火箭電泳,單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術(shù)，實質(zhì)上是加速度的單向擴散。在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標(biāo)本后，將抗原置陰極端，進(jìn)行電泳?？乖鞠蜿枠O，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀隨著泳動抗原的減少，沉淀逐漸減少， 形成峰狀的沉淀區(qū)，形狀 似火箭，抗體濃度保持不 變，峰的高度與抗原量呈 正比。,+,三、補體結(jié)合試驗(Complement fixation test ,CFT),當(dāng)抗體與細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆?？乖Y(jié)合并形成抗原抗體復(fù)合物后，可結(jié)合補體引起溶菌、溶血效應(yīng)。用補體結(jié)合試驗既可以測知患者血清中補體的總量，也可以檢測未知抗原或抗體的量。 測定人血清補體總量的方法

18、是以綿羊紅血球的溶血為指示。當(dāng)綿羊紅血球與抗綿羊紅血球結(jié)合后，加患者血清，觀測溶血程度。,補體結(jié)合試驗,四、中和試驗(Neutralization test),特異性抗體抑制多種抗原的生物學(xué)活性（細(xì)菌外毒素的毒性、酶的活性、病毒的感染性等）的反應(yīng)。例如在臨床實驗診斷中測定風(fēng)濕病患者體內(nèi)的抗鏈球菌 O抗體的反應(yīng)。,第四節(jié) 免疫親和層析,生物高分子具有能和某種相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，例如酶的活性中心或別構(gòu)中心能和專一的底物、抑制劑、輔助因子效應(yīng)劑通過某些次級鍵相結(jié)合，并在一定條件下又可以解離?？贵w與抗原，激素及其受體，核糖核酸與其互補的脫氧核糖核酸等體系，都具有類似的特性。這種高分子和配基

19、之間形成專一的可解離的復(fù)合物的能力稱為親和力。根據(jù)這種具有親和力的生物分子間可逆的結(jié)合和解離的原理發(fā)展起來的層析就稱為親和層析。,親和層析法的基本過程： 1、偶聯(lián)：將欲分離的高分子物質(zhì)的配基在不影響其生物功能的情況下與水不相溶性的載體結(jié)合，制成親和吸附劑或免疫吸附劑。 2、裝柱：在層析柱內(nèi)裝入固相化的配基 3、親和層析：含有高分子物質(zhì)的混合液在有利于配基和高分子之間形成復(fù)合物的條件下進(jìn)入裝有親和吸附劑的層析柱。高分子物質(zhì)結(jié)合留在柱內(nèi)，其他雜質(zhì)流出。 4、洗脫：改變條件，促使配基和高分子物質(zhì)分離而釋放出需要的物質(zhì)。 5、再生：將親和層析柱的充分洗滌再生，用于下一周期的純化工作。,The End,

20、三、現(xiàn)代免疫標(biāo)記技術(shù),免疫標(biāo)記技術(shù)(Immuno-labelling technique)是指將抗原或抗體用熒光素、酶、放射性同位素和電子致密物質(zhì)等加以標(biāo)記，借以提高其靈敏度的一類新技術(shù)。 優(yōu)點：特異性強、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、反應(yīng)速度快、容易觀察、能定位、定量甚至定位。,旺雕彤俊侖肖負(fù)規(guī)謊寇傻抵世編蹬憂侄到資同章哪份貴炬臘邯兌兇非粹舀抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用,1、免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique),將結(jié)合有熒光素的熒光抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的技術(shù)。 常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC)

21、和羅丹明（lissamine rhodamine B200,RB200)等。它們可與抗體球蛋白中賴氨酸的氨基結(jié)合，在藍(lán)紫光激發(fā)下，可分別出現(xiàn)鮮明的黃綠色及玫瑰紅色。,伺楚爹霧魏毯髓荊朝計宙叼遲們煥岸檬遂聘蛻字俊礦薛腐賤客代狗雜鋁娜抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用,2、酶免疫測定（Enzyme immunoassay,EIA),用酶標(biāo)記的抗體或抗抗體來進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。 用酶代替熒光素作標(biāo)記物以及顯示酶標(biāo)記抗體的方法是用酶的特殊底物來處理標(biāo)本。由于酶的催化作用可使原來無色的底物通過水解、氧化或還原反應(yīng)而顯示顏色。,和瞎倉滅荔爛疆魯先府哀選煎憑匠宗滁枉持宗釋叛茬泉箱韋的啦申樟鞍畝抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用,免疫酶測定的優(yōu)點,1）反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生顏色，可用顯微鏡觀察結(jié)果。 2）標(biāo)本經(jīng)酶標(biāo)抗體染色后，還可用其他染料復(fù)染，顯示細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。 3）標(biāo)本可長久保存，隨時備查。 4）特異性強。 5）靈敏度高。,澡幻坑創(chuàng)琳略趴罩此袍六你普喚奢裳旨冉賂談日茸擇山衙乖嬸銷鶴巷紅臍抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用,標(biāo)記酶應(yīng)具備的特點,1）純度高、高溶性、特異性強、穩(wěn)定性高。 2）測定方法應(yīng)簡單、敏感、快速。 3）與底物作用后會呈