1、慢性乙肝實(shí)驗(yàn)室檢測及臨床意義,李 剛 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院傳染病科 2004年5月,1 血清酶檢測 血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase， ALT）：是目前臨床上反映肝細(xì)胞功能的最常用指標(biāo)。急性肝炎時(shí)ALT明顯升高，黃疸出現(xiàn)后ALT開始下降；慢性肝炎和肝硬化時(shí)ALT輕度或中度升高或反復(fù)異常；重型肝炎患者可出現(xiàn)ALT快速下降，膽紅素不斷升高的酶、膽分離現(xiàn)象，提示肝細(xì)胞大量壞死。,1 血清酶檢測 天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(asparate aminotransferase，AST) ：特異性較ALT低。此酶在心肌含量最高，依次為肝、骨骼肌、腎、胰。在肝病時(shí)血清AST升高，當(dāng)病

2、變持久且較嚴(yán)重時(shí)，線粒體中AST釋放入血流，其值可明顯升高。急性肝炎時(shí)如果AST持續(xù)在高水平，有轉(zhuǎn)為慢性肝炎的可能。,AST/ALT： 急性肝炎時(shí)AST/ALT常小于1，慢性肝炎和肝硬化時(shí)AST/ALT常大于1。比值越高，則預(yù)后愈差，病程中AST/ALT比值降低，提示未損及肝細(xì)胞線粒體，預(yù)后較佳。,堿性磷酸酶：當(dāng)肝內(nèi)或肝外膽汁排泄 受阻時(shí)，血清ALP活性升高。 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶：肝炎和肝癌患者可 顯著升高，在膽管阻塞的情況下更明顯，-GT活性變化與肝臟病理改變有良好的一致性。 乳酸脫氫酶：肝病時(shí)可顯著升高。 膽堿酯酶：其活性降低提示肝細(xì)胞已有較明顯損傷，其值愈低，提示病情愈重。,2 血清蛋白： 主

3、要由白蛋白（A），1，2，及球蛋白組成。前4種主要由肝細(xì)胞合成，球蛋白主要由漿細(xì)胞合成。在急性肝炎時(shí)，由于白蛋白半衰期較長，約21天，以及肝臟的代償功能，血清蛋白質(zhì)和量可在正常范圍內(nèi)。慢性肝炎中度以上、肝硬化、重型肝炎時(shí)出現(xiàn)白蛋白下降，球蛋白升高，白/球（A/G）比例下降甚至倒置。,3 膽紅素： 急性或慢性黃疸型肝炎時(shí)血清膽紅素升高，活動性肝硬化時(shí)亦可升高且消退緩慢，重型肝炎常超過171mol/L。一般情況下，肝損程度與膽紅素含量呈正相關(guān)。直接膽紅素在總膽紅素中的比例尚可反映淤膽的程度。,4 凝血酶原活動度（PTA）： PTA高低與肝損程度成反比。PTA40是診斷重型肝炎的重要依據(jù)，PTA亦是

4、判斷重型肝炎預(yù)后的敏感指標(biāo)。 對照-(對照 0.6) PTA= 100% 樣本-(對照 0.6),5 血氨： 肝衰竭時(shí)清除氨的能力減退或喪失，導(dǎo)致血氨升高，常見于重型肝炎，肝性腦病患者。,6 血常規(guī)： 急性肝炎時(shí)白細(xì)胞稍低或正常，淋巴細(xì)胞相對增多，偶可見異型淋巴細(xì)胞。重型肝炎時(shí)白細(xì)胞可升高，紅細(xì)胞下降，血紅蛋白下降。肝炎肝硬化伴脾功能亢進(jìn)者可有血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞減少的“三少”現(xiàn)象。,7 尿常規(guī)： 尿膽紅素和尿膽原的檢測是早期發(fā)現(xiàn)肝炎的簡易有效方法，同時(shí)有助于黃疸的鑒別診斷。肝細(xì)胞性黃疸時(shí)兩者均陽性，溶血性黃疸時(shí)以尿膽原為主，梗阻性黃疸以尿膽紅素為主。妊娠急性脂肪肝患者尿膽紅素常陰性，有助于

5、與妊娠急重型肝炎鑒別。,8 電解質(zhì) 重型肝炎常見低K+、低Na+，低Cl-，亦可有低Ca2+、低Mg2+、低P2- 等。肝腎綜合征時(shí)可出現(xiàn)高K+。,9 血糖 超過40重型肝炎患者有血糖降低，臨床上應(yīng)注意低血糖昏迷與肝性腦病的鑒別。,10 血漿膽固醇 60-80的血漿膽固醇來自肝臟，肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，膽固醇在肝內(nèi)合成減少，故血漿膽固醇明顯下降，膽固醇愈低，預(yù)后愈險(xiǎn)惡。梗阻性黃疸時(shí)膽固醇升高。,11 補(bǔ)體 當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，補(bǔ)體合成減少。臨床檢測CH50和C3補(bǔ)體對預(yù)后有評估作用。,12 甲胎蛋白（AFP） HBV和HCV感染與肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)生有明顯相關(guān)性，AFP含量的檢測是篩選和早期診

6、斷HCC的常規(guī)方法。肝炎活動和肝細(xì)胞修復(fù)時(shí)AFP有不同程度的升高。應(yīng)進(jìn)行動態(tài)觀察。急性重型肝炎AFP升時(shí)，提示有肝細(xì)胞再生，為預(yù)后良好的標(biāo)志。,13 膽汁酸 血清中膽汁酸含量很低，當(dāng)肝炎活動時(shí)膽汁酸升高。由于肝臟對膽紅素和膽汁酸的運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)不同，檢測膽汁酸有助于鑒別膽汁淤積和高膽紅素血癥。,14 肝纖維化指標(biāo) 一些檢測項(xiàng)目已在臨床上應(yīng)用，如型前膠原肽、型膠原，層連蛋白、透明質(zhì)酸、脯氨酰羥化酶等，對肝纖維化的診斷有一定參考價(jià)值，但缺乏特異性。,15 影像學(xué)檢查 B型超聲波有助于鑒別阻塞性黃疸、脂肪肝及肝內(nèi)占位性病變。對肝硬化有較高的診斷價(jià)值，能夠反映肝臟表面變化，門靜脈、腦靜脈直徑，脾臟大小，膽囊

7、異常變化，腹水等。彩色超聲波尚未可觀察到血流速度。在重性肝炎中可動態(tài)觀察肝臟大小變化等，CT的應(yīng)用價(jià)值基本同B型超聲波，但其有損傷性和價(jià)值昂貴，如應(yīng)用增強(qiáng)劑，可加重病情。,16 肝活檢病理檢查 其意義包括對病毒性肝炎作出病理診斷，對不典型病例作出明確判斷，有助于治療效果評價(jià)及觀察預(yù)后轉(zhuǎn)歸，還可從組織中檢測病原標(biāo)志以明確感染。,17 病原學(xué)檢查,HBV基 因 及 編 碼 蛋 白,乙型肝炎,HBsAg與抗HBs HBsAg在感染HBV兩周后即可陽性。只要HBsAg陽性就可診斷HBV感染，陰性則不能排除HBV感染。 抗HBs為保護(hù)性抗體，陽性表示對HBV有免疫力。低滴度應(yīng)注意假陽性。,乙型肝炎,HB

8、sAg與抗HBs HBV感染后可出現(xiàn)HBsAg和抗HBs同時(shí)陰性， 即所謂窗口期，此時(shí)HBsAg已消失，抗HBs仍 未產(chǎn)生，少部分病例始終不產(chǎn)生抗HBs。 HBsAg和抗HBs同時(shí)陽性可出現(xiàn)在HBV感染 恢復(fù)期，此時(shí)HBsAg未消失，抗HBs已產(chǎn)生； 另一情形是S基因區(qū)發(fā)生變異，野生株抗HBs 不能將其清除；或抗HBs陽性者感染了免疫逃 避株,HBsAg,常用ELISA法檢測。 目前HBsAg診斷試劑質(zhì)量較高， 靈敏度可達(dá)0.2ng/L。從全國 室間質(zhì)控評價(jià)結(jié)果顯示，陽 性標(biāo)本檢出率達(dá)到或超過98。 HBsAg滴度越高，HBeAg、 HBV DNA陽性的可能性越大。 血液與肝組織的HBsAg含

9、量并不完 全相關(guān),HBsAg陽性就可診斷HBV現(xiàn)癥感染嗎？,為什么血清HBsAg陰性不能排除HBV感染？ 檢測試劑不夠敏感。 Abbott試劑盒由ad亞型抗體和抗原制備， 對ay亞型的靈敏度較低。 S基因變異（抗原性發(fā)生改變）。 X基因變異（轉(zhuǎn)錄受抑制）。 重疊HCV感染（干擾HBsAg合成）。,HBsAg抗原性 aa124-147 HBsAg共同決定簇“a” aa122 確定HBsAg亞型d/y， 賴氨酸/精氨酸 aa160 確定HBsAg亞型w/r， 賴氨酸/精氨酸,能導(dǎo)致HBsAg陰性的S區(qū)變異 aa124 半胱氨酸 酪氨酸 aa129 谷氨酸 天冬氨酸 aa131 蘇氨酸 天冬氨酸 a

10、a131 蛋氨酸 蘇氨酸 aa122-124 插入氨基酸 前S1/S2部分缺失,如何診斷血清HBsAg陰性的HBV感染？ 提高檢測敏感性 采用針對變異抗原的檢測試劑 HBV DNA的檢測 組織中標(biāo)志物的檢測,提高檢測HBsAg敏感性方法 Aoki基于電子旋轉(zhuǎn)共振技術(shù)的HBsAg EIA方法，檢測HBsAg中穩(wěn)定的氮氧基因。在30例HBsAg陰性樣本中，檢出11例陽性。,抗HBs陽性就萬無一失了嗎？ 低滴度應(yīng)注意假陽性 單一抗HBs陽性HBV DNA檢出率0-11.8%： 先后感染了不同的HBV亞型 S基因變異 X基因變異,抗HBs陽性HBV DNA陰性 并不排除肝細(xì)胞內(nèi)HBV的存在,HBsAg

11、與抗HBs共存 可出現(xiàn)在HBV感染的恢復(fù)期，此時(shí) HBsAg未消失，抗HBs已產(chǎn)生，大部 分歸功于檢測敏感性的提高。 S基因發(fā)生變異，野生株抗HBs不能將 其清除； 抗HBs陽性者感染了不同亞型HBV或 免疫逃避株。,基因變異導(dǎo)致HBsAg與抗HBs共存 aa126 蘇氨酸 絲、異亮氨酸 aa141 賴氨酸 谷氨酸 aa145 甘氨酸 精氨酸 前S1 nt3025-3154缺失,乙型肝炎,HBeAg與抗HBe HBeAg的存在表示病毒復(fù)制活躍且有 較強(qiáng)的傳染性。HBeAg消失而抗HBe產(chǎn)生 稱為血清轉(zhuǎn)換?？笻Be陽轉(zhuǎn)后，病毒復(fù)制 多處于靜止?fàn)顟B(tài)，傳染性降低。長期抗 HBe陽性者并不代表病毒復(fù)制

12、停止或無傳 染性，研究顯示20%50%仍可檢測到HBV DNA，部分可能由于前C區(qū)基因變異，導(dǎo) 致不能形成HBeAg。,HBeAg 是重要的免疫耐受因子，大部分情 況下其存在表示患者處于高感染低 應(yīng)答期。 HBeAg與HBV DNA有良好的相關(guān) 性。 陽性標(biāo)本檢出率90左右。,HBeAg水平與HBV DNA的關(guān)系 HBeAg 134PEIU/L, HBV DNA 6.931.03e。 HBeAg 0.28134PEIU/L, HBV DNA 5.581.84e 。,HBeAg陰性/抗HBe陽性，HBV DNA陽性HBV感染是否均由前C區(qū)變異導(dǎo)致？,HBeAg陰性/抗HBe陽性，HBV DNA陽

13、性 基因變異 HBV低水平復(fù)制 重疊HCV感染。,基因變異導(dǎo)致HBeAg陰性/抗HBe陽性，HBV DNA陽性HBV感染 前C區(qū)1896位G A，形成終止密碼， HBeAg合成終止。 前C區(qū)缺失或插入變異，改變HBeAg 的抗原性，常規(guī)試劑檢測陰性。 C區(qū)變異，導(dǎo)致HBeAg的抗原性改變。 C基因啟動子點(diǎn)突變或起始密碼點(diǎn)突變。 X區(qū)變異使mRNA轉(zhuǎn)錄受抑制，導(dǎo)致 HBeAg合成減少，甚至難以檢出。,HBeAg陰性/抗HBe陽性，HBV DNA陽性HBV感染 HBV DNA水平一般較低。 90%以上由于nt1896位突變引起。 多發(fā)生于D型HBV。,HBeAg與抗HBe共存 血清轉(zhuǎn)換過程中。 檢

14、測敏感性提高。 野生株與變異株同時(shí)存在。,乙型肝炎,HBcAg與抗HBc HBcAg陽性表示血清中存在Dane顆粒， HBV處于復(fù)制狀態(tài)，有傳染性。抗HBc IgM是 HBV感染后較早出現(xiàn)的抗體，絕大多數(shù)出現(xiàn)在 發(fā)病第一周，多數(shù)在6個(gè)月內(nèi)消失。高滴度的 抗HBc IgM對診斷急性乙型肝炎或慢性乙型肝 炎急性發(fā)作有幫助。單一抗HBc IgG陽性者可 以是過去感染，因其可長期存在；亦可以是 低水平感染，特別是高滴度者。,抗HBc陰性的HBV感染 免疫耐受。 檢測試劑原因，目前試劑準(zhǔn)確性 約85%。 C區(qū)突變。,檢測HBV-M水平有無意義？ HBsAg水平與HBeAg及HBV DNA 。 抗HBs水

15、平與是否注射疫苗。 HBeAg水平與HBV DNA。 與抗病毒治療。 抗HBc水平與現(xiàn)癥感染。,血液中HBV-M水平是否與肝組織中HBV-M水平成正比關(guān)系？,乙型肝炎,HBV DNA 病毒復(fù)制和傳染性的直接標(biāo)志。HBV DNA 定量對于判斷病毒復(fù)制程度，傳染性大小， 病毒藥物療效等有重要意義。HBV DNA檢測方 面，還有前C區(qū)變異、S區(qū)變異和多聚酶基因 YMDD變異等檢測。,HBV DNA拷貝數(shù)乙肝病毒載量,為什么建議每個(gè)病人都要進(jìn)行 HBV DNA檢測？,HBV DNA檢測的臨床意義 診斷方面： HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù) HBV DNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志 HBV DNA是患者

16、具有傳染性的標(biāo)志,HBV DNA檢測的臨床意義, 對HBV-M起補(bǔ)充作用： HBeAg()/ 抗HBe()乙型肝炎 （前C區(qū)變異） HBsAg()乙型肝炎 （S區(qū)變異） 低水平感染 單項(xiàng)抗HBc()乙型肝炎,HBV DNA檢測的臨床意義, 療效判斷： HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo) 預(yù)后判斷 HBV DNA水平與病情有一定的關(guān)系,HBV DNA檢測的臨床意義,調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽”的病人HBV都無復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過檢測HBV DNA來決定。,HBV DNA檢測

17、方法, 斑點(diǎn)雜交（基本淘汰） 定性PCR（基本淘汰） 定量PCR（主流） 基因芯片（將來）,HBV DNA檢測方法的比較,斑點(diǎn)雜交 PCR 定量PCR 敏感性 105 102 102 特異性 高 稍低 高 重復(fù)性 好 稍差 好 定量范圍 4 6 6 簡便 較繁瑣 簡便 簡便 安全性 好 好 好 設(shè)備 便宜 稍貴 昂貴 技術(shù)要求 低 高 高 檢測價(jià)格 低 中 高,基因芯片與HBV DNA定量檢測HBV結(jié)果比較 基因芯片 陽性 陰性 陽性 19 4 HBV DNA定量 陰性 2 15 符合率為85%(34/40)，芯片檢出率為82.61%(19/23), 假陽性率為11.76%(2/17).,基因

18、芯片與HCV RNA定量檢測HCV結(jié)果比較 基因芯片 陽性 陰性 陽性 7 5 HCV RNA定量 陰性 1 27 符合率為85%(34/40)，芯片檢出率為58.33%(7/12), 假陽性率為3.57%(1/28)。,基因芯片與錯(cuò)配PCR檢測YMDD變異株結(jié)果比較 基因芯片 陰性 YMDD YVDD YIDD 混合 錯(cuò) 陰性 3 0 0 0 0 配 YMDD 1 3 1 1 2 PCR YVDD 1 2 5 0 0 YIDD 0 0 0 0 1 混合 0 0 0 0 0 5份芯片檢測的標(biāo)本與DNA序列測定結(jié)果一致,為什么建議每個(gè)病人都要進(jìn)行 HBV DNA檢測？ 從HBV DNA與HBV-

19、M的關(guān)系中可得到解答,我科1474例 HBV-M與HBV DNA結(jié)果分析 HBsAg HBeAg HBcAb HBsAb HBeAb 例數(shù) HBV DNA(+) 例數(shù)(%) 1 + + + - - 603 520（86.2） 2 + - + - + 465 163（35.1） 3 + + - - - 19 18（94.2） 4 + - + - - 216 88（40.7） 5 + - - - + 5 3（60） 6 - - + + + 20 1（5） 7 - - + + - 27 1（3.7） 8 - - + - + 24 2（8.0） 9 - - - + + 1 0（0） 10 - - -

20、+ - 56 2（3.6） 11 - - + - - 26 3（11.5） 12 + + + + - 2 2（100） 13 - - - - - 10 0（0） 合計(jì) 1474 803,HBV-M與HBV DNA關(guān)系 本科 四川 湖南 解放軍 南方醫(yī)院 “ 大三陽” 86.2 85.0 87.3 94.38 93.4 “小三陽” 35.1 20.3 25.6 27.3 83.8 “ 小二陽” 40.7 27.6 48.8 38.56 80.5 抗HBc 11.5 10.8 39.3 抗HBs 3.6 0 9.7 0 三抗體陽 5.0 1.1 10.0 全陰 0 4.0 調(diào)查總例數(shù) 1474 2

21、828 814 838 773 HBV DNA陽性率,HBsAg和HBeAg均陽性而HBV DNA陰性 可能有以下原因： (1) 干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制 受抑制。 (2) PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生 突變，此引物與突變DNA不能配對結(jié) 合。 (3) 病毒DNA整合于宿主肝細(xì)胞染色體而 血中游離HBV DNA很少或缺乏。,乙型肝炎,組織中HBV標(biāo)志物的檢測 可用免疫組織化學(xué)方法檢測肝組織 中HBsAg、HBeAg的存在及分布；原位雜 交或原位PCR方法檢測組織中HBV DNA的 存在及分布。除可判定病毒是否處于復(fù) 制狀態(tài)外，對血清中HBV標(biāo)志物陰性病人 的診斷有一定意義。,有關(guān)

22、YMDD變異株的檢測,YMDD變異,YMDD 酪氨酸蛋氨酸天門冬氨酸天門冬氨酸。如發(fā)生YMDD變異，則其中的蛋氨酸（M）突變?yōu)楫惲涟彼幔╥soleucine，I）或纈氨酸（valine，V）形成YIDD變異株或YVDD變異株 。 YMDD位于HBV多聚酶的關(guān)鍵功能區(qū)。,有關(guān)YMDD變異株的檢測 拉米夫定治療后HBV DNA復(fù)陽是否均由YMDD變異引起？ 如果是，不用檢測YMDD，只需檢測HBV DNA即可。,有關(guān)YMDD變異株的檢測,我科7例出現(xiàn)耐藥性的患者中，6例發(fā)現(xiàn)有YMDD變異。提示耐藥性的發(fā)生主要是由于YMDD變異所造成，但可能存在YMDD變異以外的其他因素。,有關(guān)YMDD變異株的檢測

23、 Alleb報(bào)道20例拉米夫定治療后耐藥病例，所有均存在YMDD變異。 Gane報(bào)道8例拉米夫定治療后耐藥病例，所有均存在YMDD變異。,有關(guān)YMDD變異株的檢測,自然條件下存在YMDD變異株。 我科發(fā)現(xiàn)一例。 Kobayashi報(bào)道18例ALT正常HBV無癥狀感染者中，5例拉米夫定治療前為YMDD變異株。,有關(guān)YMDD變異株的檢測,既然自然條件下存在YMDD變異株，拉米夫定治療前是否應(yīng)進(jìn)行YMDD變異株的檢測？,有關(guān)YMDD變異株的檢測,YIDD可能是YMDD 突變?yōu)閅VDD的中間產(chǎn)物，是否意味著檢測時(shí)應(yīng)區(qū)分YIDD變異株還是YVDD變異株？,甲型肝炎 抗HAV IgM：在發(fā)病后數(shù)天即可陽性

24、，36月轉(zhuǎn)陰。是早期診斷甲型肝炎最簡便而可靠的血清學(xué)標(biāo)志。 抗HAV IgG：出現(xiàn)稍晚，于23個(gè)月達(dá)到高峰，持續(xù)多年或終身?？笻AV IgG陽性表示受過HAV感染。屬于保護(hù)性抗體，具有免疫力的標(biāo)志。,丙型肝炎,抗HCV IgM和抗HCV IgG：HCV抗體不是保護(hù)性抗體，是存在HCV感染的標(biāo)志?？笻CV IgM在發(fā)病后即可檢測到，一般持續(xù)13個(gè)月。如果抗HCV IgM持續(xù)陽性，提示病毒持續(xù)復(fù)制，易轉(zhuǎn)為慢性。低滴度抗HCV IgG提示病毒處于靜止?fàn)顟B(tài)，高滴度提示病毒復(fù)制活躍。,丙型肝炎,HCV RNA HCV RNA陽性是病毒感染和復(fù)制的直接標(biāo)志。HCV RNA亦可定量，定量測定有助于了解病毒復(fù)制程度、抗病毒治療的選擇及療效評估等。,有關(guān)丙型肝炎的病原檢測,為什么要同時(shí)檢測抗HCV及HCV RNA？ 抗病