1、Roche TBIL和DBIL項目介紹TBIL和DBIL檢測方法學比較,Denny Dong; Dec 07, 2012,主要內容,膽紅素的代謝 膽紅素的分類和臨床應用 膽紅素的檢測方法 羅氏膽紅素試劑盒特點 膽紅素檢測的標準化,膽紅素是膽汁中的主要色素，呈橙黃色。 膽紅素具有：脂溶性，難溶于水。 毒性作用 抗氧化（抑制亞油酸和磷脂的氧化） 膽色素代謝以膽紅素代謝為中心。 肝臟在膽色素代謝中起著重要作用,反 映 肝 臟 的 分 泌 與 排 泄 功 能。,膽紅素測定的作用,膽紅素的來源,來源,其它鐵卟啉化合物：肌紅蛋白、過氧化物酶、過氧化氫酶、細胞色素等,血紅蛋白（主要來源，約占80%）由衰老的

2、RBC破壞、釋放出的Hb分解,膽紅素的生成,部 位：肝、脾及骨髓等網狀內皮細胞中,衰老紅細胞,血紅蛋白,珠蛋白,血紅素,膽紅素,膽綠素,NADPH+H+,(250300 mg/天),膽紅素在血液中的運輸,膽紅素：脂溶性，難溶于水,增高膽紅素的水溶性，有利于運輸 限制膽紅素通透細胞膜對組織造成毒性作用,血液：白蛋白,膽紅素,白蛋白膽紅素復合物 （可逆結合）,競爭結合劑： 如磺胺藥，水楊酸，膽汁酸等,膽紅素在肝中的轉變,嬰兒出生7周后，體內Y蛋白才會達成人水平,1. 攝取,白蛋白膽紅素 復合物,血液,2. 轉化 膽紅素 + UDPGA 葡萄糖醛酸膽紅素 (結合膽紅素),葡萄糖醛酸基轉移酶,（1）水

3、溶性增強，易從膽汁排出，也易透過腎小球從尿排出。 （2） 不易通過細胞膜和血腦屏障,膽紅素在肝中的轉變,膽紅素在腸道中的變化,結合膽紅素 膽紅素 膽素原（無色） (中膽素原、糞膽素原、尿膽素原) 糞膽素 尿膽素,葡萄糖醛酸基,膽素,腸道細菌,非結合膽紅素,膽紅素在體內的代謝,膽汁,膽色素代謝總結,主要內容,膽紅素的代謝 膽紅素的分類和臨床應用 膽紅素的檢測方法 羅氏膽紅素試劑盒特點 膽紅素檢測的標準化,膽紅素的分類,（1）未結合膽紅素(Bu)：未與葡萄糖醛酸基結合，具親脂性，須加入加速劑破壞分子內部的氫鍵后才能與重氮試劑反應，又稱間接膽紅素。占總膽紅素的4/5。 （2）結合膽紅素(Bc) ：與

4、葡萄糖醛酸基結合，具親水性，與重氮試劑直接反應，又稱直接膽紅素(DBIL)。占總膽紅素的1/5。,非結合膽紅素的結構（ ,Bu）,血紅蛋白的降解產物 在血液中和白蛋白以非共價鍵的方式結合 在肝臟被清除 折疊的結構，幾乎不溶于水。 不能直接參與重氮反應 是新生兒生理性黃疸的最好指標,結合膽紅素(和;Bc),在肝細胞內由非結合膽紅素轉化而來 在肝臟的酶作用，生成了單葡萄糖醛酸酯膽紅素和雙葡萄糖醛酸酯膽紅素 造成膽紅素分子內各基團間原有距離增大，難以再形成氫鍵，由此，使膽紅素的親水基團暴露在外，表現出水溶性，便于從膽管排入腸道。 是膽道梗阻解除后最敏感的指標 可直接參與重氮反應，表現為直接反應的膽紅

5、素。,血清膽紅素與黃疸,正常血清 未結合膽紅素:占4/5（有毒） 總膽紅素 17.1umol/L 結合膽紅素：占1/5（無毒）,34.2 umol/L 鞏膜、皮膚、 黃疸 粘膜黃染 (顯性） 17.1- 34.2 umol/L 無黃染 隱性黃疸,黃疸的種類(按血清膽紅素的來源)： 溶血性黃疸 又稱肝前性黃疸。 膽紅素的來源肝臟的轉化能力 游離膽紅素過多 肝細胞性黃疸 又稱肝原性黃疸。 肝臟轉化能力降低 游離和結合膽紅素均升高 阻塞性黃疸 又稱肝后性黃疸。 結合膽紅素排泄障礙 結合膽紅素過多,黃疸是指高膽紅素血癥引起皮膚、鞏膜和粘膜等組織黃染的現象。,黃疸的鑒別診斷,膽紅素檢測的臨床意義,（1）

6、黃疸及鑒別 DBi/TB 比值 60% 阻塞性黃疸 （2）肝細胞損害程度和預后的判斷。 （3）新生兒黃疸病情掌握。 （4）再障等疾病，TB減少。,膽紅素的異常代謝,黃疸 1、膽紅素（橙黃色）+彈性蛋白 組織黃染 鞏膜、皮膚、黏膜 2、根據血漿膽紅素濃度，黃疸程度： 隱性黃疸（1.02.0mg/dl） 顯性黃疸（ 2.0mg/dl）,黃疸的發(fā)生機制,非結合膽紅素增高 溶血性黃疸 新生兒黃疸,結合膽紅素增高 結合后轉運障礙： Dubin-Johnson 綜合癥 膽道梗阻: 膽結石,結合障礙 - 生理性黃疸 - Crigler- Najjar 綜合癥,攝取減少 :Gilbert綜合癥,血漿,肝細胞,

7、Bile canaliculi,A,Bu,A,Bu,A,di G,Bc,G,Bc,di G,Bc,葡萄糖醛酸轉移酶,A,Bu,A,A,Bu,溶血性黃疸（肝前性黃疸）,溶血血漿游離膽紅素 肝臟中結合膽紅素腸道中膽素原重吸收尿膽素原尿膽素 但是，血漿結合膽紅素不變，尿膽紅素陰性,溶血血漿游離膽紅素 肝臟中結合膽紅素腸道中膽素原重吸收 尿膽素原尿膽素 但是，血漿結合膽紅素不變，尿膽紅素陰性。,結合膽紅素,肝細胞性黃疸（肝原性黃疸）,肝臟對膽紅素的攝取、轉化障礙血漿游離膽紅素 肝內毛細膽管破裂，結合膽紅素返流入血血漿結合膽紅素尿膽紅素陽性 尿膽素原、尿膽素 不確定,肝臟對膽紅素的攝取、轉化障礙血漿游離

8、膽紅素；同時： 肝內毛細膽管破裂，結合膽紅素返流入血血漿結合膽紅素尿膽紅素陽性 重氮試劑間接、直接反應雙陽性；尿膽素原、尿膽素 不確定,阻塞性黃疸（肝后性黃疸）,膽管阻塞破裂血漿結合膽紅素尿膽紅素陽性 腸道中膽素原生成、重吸收減少尿膽素原、尿膽素 游離膽紅素不變；尿三膽,1、膽管阻塞破裂血漿結合膽紅素尿膽紅素陽性 2、腸道中膽素原生成、重吸收減少尿膽素原、尿膽素 3、重氮試劑間接、直接反應雙陽性；游離膽紅素不變,三種黃疸的臨床檢驗特征,新生兒生理性黃疸,新生兒血液內原來過多的紅細胞被破壞，未結合膽紅素生成過多。 嬰兒出生7周后，體內Y蛋白才會達成人水平，肝細胞內載體蛋白Y蛋白少，肝細胞攝取未結

9、合膽紅素的能力不足。 肝細胞內膽紅素葡萄糖醛酸基轉移酶生成不足，結合膽紅素生成少。 肝細胞膽汁分泌器發(fā)育不完善，對肝膽汁分泌的潛力不大。 母乳中含有孕二醇，對葡萄糖醛酸基轉移酶有抑制作用。,過多的游離膽紅素可與腦部基底核的脂類結合，并干擾腦的正常功能，稱膽紅素腦病或核黃疸。,如：新生兒黃疸/高膽紅素血癥,反相HPLC (A436 nm)分離法,時間 (min),:Bu 未結合膽紅素,:mBc 單葡萄糖醛酸結合膽紅素,:Bd 與白蛋白共價結合的膽紅素,Kuenzle CC, et al.: 四種血清膽紅素及三種膽汁膽紅素的分離和定量檢測。J Lab Clin Med 1966; 67:282 L

10、auff JJ, et al.: 血清和膽汁膽紅素反相HPLC分離法。 J Chromatogr 1981; 226:391,:dBc 雙葡萄糖醛酸結合膽紅素,膽紅素的四種成分,在血液循環(huán)中結合膽紅素和白蛋白形成的。 白蛋白緩慢地非酶作用置換了原葡萄糖醛酸酯。類似于糖化血紅蛋白。 在長期的高結合膽紅素血癥患者的血液內，才能被檢測出來。 在血液循環(huán)中的清除緩慢。半衰期2-3周。 因為膽紅素不存在氫鍵的影響，所以膽紅素可以與重氮直接膽紅素反應。 B不能通過腎小球故不從尿排出。 B只存在于人血清而不存在于膽汁，說明它不從膽汁排出，即它的代謝調節(jié)不依賴肝膽的排泄功能,膽紅素,B的代謝及其在疾病時表現與

11、其它三種組份有重要差別。 正常人血清中沒有B。 新生兒黃疸：以Bu為主黃疽。 體質性肝功能不良性黃疸：(Gilberts綜合癥,葡萄糖醛酸基轉移酶(UGT)不足引起）B占TBIL50%。 認為B源于Bc。它的形成與肝的結合，與肝功能的成熟有關。,膽紅素,Me,R,COOR2,CH2,CH2,Me,Me,Me,R,N H,CH,O,N H,CH,N H,N H,O,CH2,COOR1,CH2,CH2,mBc = R1 = glucuronic acid and R2 = H (monoglucuronide) dBc = R1 and R2 = glucuronic acid (diclucur

12、onide),結合膽紅素的結構,Me,R,COOH,CH2,CH2,Me,Me,Me,R,N H,CH,O,N H,CH,N H,N H,O,CH2,非結合膽紅素的結構,Me,R,COO,CH2,CH2,Me,Me,Me,R,N H,CH,O,N H,CH,N H,N H,O,CH2,COO,CH2,CH2,膽紅素: R1 或 R2 = 白蛋白 共價鍵結合白蛋白,白蛋白,膽紅素結構,主要內容,膽紅素的代謝 膽紅素的分類和臨床應用 膽紅素的檢測方法 羅氏膽紅素試劑盒特點 膽紅素檢測的標準化,膽紅素檢測的常用方法分類,1.重氮鹽法diazo reaction 原理：橙黃色的膽紅素與重氮鹽反應生成有

13、色的偶氮膽紅素 （偶氮膽紅素在酸性PH值為紅色，堿性PH值為藍色） 一般在酸性環(huán)境下，主波長546nm，次波長800nm 2.氧化法-oxidative methods 原理：橙黃色的膽紅素被氧化成綠色的膽綠素 450nm主波長，546nm次波長 3.直接分光光度法（Direct Spectrophotometry） 原理：直接檢測膽紅素的顏色，波長460nm （血清指數） 4.高壓液相色譜（HPLC） 5.經皮直接測量（transcutaneous methods）,膽紅素常用生化檢測方 法,重氮鹽法diazo reaction 2，5-二氯苯重氮四氟硼酸鹽法（DPD法） 改良Malloy-

14、Evelyn法 Jendrassik-GrOf 法 改良JG法 改良間氨基苯磺酸法 強生干片法 氧化法oxidative（enzymatic29 Suppl 126:Abstract 11.12.,主波長：570nm 吸收峰：紫色,Roche BIL-T (ACN101)總膽紅素試劑， 抗干擾：H75，L50,改良Malloy-Evelyn重氮法,Malloy HT, Evelyn KA. The determination of bilirubin with the photoelectric colorimeter. J Biol Chem 1937;119:481-490,Wahlefe

15、ld AW, Herz G, Bernt E. Modification of the Malloy-Evelyn method for a simple, reliable determination of total bilirubin in serum. Scand J Clin Lab Invest 1972;29 Supplement 126: Abstract 11.12.,重氮鹽： 氨基磺酸和重氮基離子， 醋酸鈉，HCL，表面活性劑,主波長：550nm 吸收峰：紫紅色,1972 Wahlefeld AW,試劑穩(wěn)定性好，抗溶血及脂血的干擾性好。,Roche TBILI(ACN294

16、) 總膽紅素試劑 抗干擾:H1000，L0100,J-G法,Jendrassik297:81-89.,改良J-G法（IFCC參考方法）,改良J-G 法2004年確認為參考方法，其靈敏度、準確度和特異性均較高，但顯色時間相對較長。,Jendrassik29:31-36.,改良間氨基苯磺酸重氮法,重氮鹽： 3,5間氨基苯磺酸 磷酸，HEDTA，NaCl,Roche BILD2(ACN734)總膽紅素試劑， 抗干擾:H25，L750,Roche 于2012年上市,試劑開瓶穩(wěn)定期為6周，加強了膽紅素的檢測，抗干擾能力得到了提升。,主波長：546nm 吸收峰：紫紅色,改良間氨基苯磺酸重氮法vs改良JG法

17、,重氮鹽：3,5間氨基苯磺酸2,5對氨基苯磺酸,緩沖體系：磷酸，HEDTA，NaCl（PH1.9） HCL，亞硝酸鈉，碳酸氫鈉（ PH1.2）,主要特點。 緩沖體系的PH值略有升高，減少了膽紅素的自然氧化。 更新緩沖體系，減少與白蛋白結合的游離膽紅素溶解在反應體系中。 重氮鹽由對位改為間位，讓重氮反應更加平穩(wěn)。提高了膽紅素的結合能力。,-優(yōu)勢 試劑開蓋上機穩(wěn)定性總體增加，可達6 周。 抗溶血和脂血干擾能力得到了提升。 肝素干擾不會導致假性偏的檢測。低的測試結果，適用于新生兒樣本。 準確度增加，可最大程度避免“直接膽紅素濃度總膽紅素濃度”的矛盾檢測結果。 均為即用型試劑盒，不需要手工制備。,改良

18、間氨基苯磺酸重氮法,二甲亞砜（DMSO）法,DMSO 法的最大優(yōu)點為反應時間短，呈色后穩(wěn)定性極佳（可穩(wěn)定近2 小時） 對脂血抗干擾性較強，受溶血干擾較輕 血紅蛋白3.5g/L 時依然有較大的干擾 只能測定總膽紅素,膽紅素氧化酶（BOD）法,膽紅素氧化酶（BOD）在堿性環(huán)境中可氧化所有膽紅素成分，包括大部分（85%）的B ，這一特性可用于總膽紅素測定。 在酸性條件下，mBc、dBc 和大部分B 均被氧化，只有Bu 不被氧化，這一特性可用于Bc（結合膽紅素或直接膽紅素）的測定。 可根據不同膽紅素反應的最適pH 差別，可分別定量測定總/直膽。 特異性強、靈敏度高、重復性好，對溶血、脂血等抗干擾性強，

19、操作簡單，適用于自動化測定等。但該法所涉及的工具酶價格昂貴，故商品試劑價格昂貴。 膽紅素氧化酶容易受到血清蛋白，尤其是白蛋白的影響，這主要由于作為底物的膽紅素在摻入血清白蛋白的 螺旋鏈時，底物便不能接近酶分子中的活性中心（這一現象稱為立體障礙）。 與血清白蛋白結合的 膽紅素在保持白蛋白 螺旋鏈的pH 范圍內對膽紅素氧化酶的作用有抵抗性。,氧化酶法特異性較好，但酶的來源、純度、穩(wěn)定性等問題，目前較少使用,釩酸鹽法,1993 年日本和光開發(fā)出商品釩酸鹽膽紅素氧化法試劑。,缺點：與d膽紅素的反應不充分，血清中膽綠素也會干擾到膽紅素的檢測，直接膽紅素，溶血對測定值會有負誤差。釩酸鹽環(huán)保問題。,Doum

20、as BT, Yein F, Perry B, et al: Determination of the sum of bilirubin sugar conjugates in plasma by bilirubin oxidase. Clin Chem 45:1255- 1260, 1999,Tbil檢測PH8，主波長450nm，吸收峰：黃色 DBIL檢測PH4，主波長450nm，吸收峰：黃色 PH10時，選擇性氧化雙葡萄糖醛酸脂和5%的的非結合膽紅素，但不包含d膽紅素，血清中膽綠素也會干擾到膽紅素的檢測。,優(yōu)點：試劑穩(wěn)定性好，抗干擾能力強。,BILD2vsDBIL1vsWako釩酸法,強生

21、Vitros 干片法膽紅素檢測,2種干片（TBil/Bubc）， 2 種方法學（重氮法/光譜法） TBIL 干片：重氮反應 以J-G方法為參考方法 使用540 nm和 460 nm波長 BuBc干片：膽紅素組分-分光光度法 以HPLC方法參考方法 使用400 nm和 460 nm波長, TBIL = Bu + mBc + dBc + Bdelta ,TBIL干片檢測膽紅素的全部組分,Vitros 膽紅素的分析方法Tbil,干片地城, BuBc = Bu + mBc + dBc,檢測的BU,檢測的BC,Vitros 膽紅素的分析方法BuBc,通過酶染劑增強游離膽紅素的反射光強度。通過不同的反射光

22、譜測量，一張干片同時檢測Bu和Bc。 由于膽紅素分于體積較大而被阻止在擴散層而無法到達反射層。所 BUBC干片不直接測定膽紅素。 膽紅素TBIIBUBC膽紅素,主要內容,膽紅素的代謝 膽紅素的分類和臨床應用 膽紅素的檢測方法 羅氏膽紅素試劑盒特點 膽紅素檢測的標準化,12144336216 P模塊小包裝12144492216 /12144506216 D模塊大包裝BIL-T ACN101DPD重氮法,檢測原理 在洗滌劑作用下釋放出間接膽紅素。隨后總膽紅素在強酸性條件下（pH值12）與2,5-二氯苯基重氮鹽耦合形成偶氮膽紅素。 膽紅素 + 重氮離子 偶氮膽紅素 形成的紅色偶氮染料的色強度與總膽紅

23、素濃度成正比，光度計測定。 試劑-工作溶液 R1 表面活性劑；鹽酸：100 mmol/L R2，R2a 表面活性劑；鹽酸：100 mmol/L；2,5-二氯苯基重氮鹽：3.0 mmol/L 穩(wěn)定性： R1：即用型42天 R2 ：配制好后14天,11822713190 P模塊小包裝11877941190 /11877950190 DP大包裝TBILI ACN 018改良Malloy-Evelyn重氮法,檢測原理 在加入適合的增溶劑后，總膽紅素與酸性介質中的重氮離子相結合。 膽紅素 + 重氮離子 偶氮膽紅素 生成的偶氮膽紅素顏色強度與總膽紅素濃度成比例，光度計測定。 試劑-工作溶液 R1C2H3N

24、aO2（乙酸鈉緩沖液）：85 mmol/L；H3NO3S （氨基磺酸）：110 mmol/L；表面活性劑；增溶劑 R2 HCl：100 mmol/L；重氮離子：3 mmol/L 穩(wěn)定性： R1：即用型35天 R2 ：即用型35天,11555413 216 P模塊小包裝BIL-D ACN294JG法,檢測原理 重氮化對氨基苯磺酸（對氨基苯磺酸與酸化亞硝酸鈉反應產生）與膽紅素反應形成偶氮膽紅素。在直接膽紅素檢測中，僅有結合膽紅素與重氮化對氨基苯磺酸反應。 膽紅素+重鹽離子 偶氮膽紅素 所形成的紅色偶氮染料的顏色強度與直接（結合）膽紅素濃度成正比，可采用光度計進行測量。 試劑-工作溶液 R1EDTA

25、：1.5 mmol/L；NaCl：152.5 mmol/L。 R22,5二氨基苯磺酸（對氨基苯磺酸）：29 mmol/L；鹽酸：170 mmol/L R2a亞硝酸鈉：25 mmol/L. 穩(wěn)定性： R1：即用型6周 R2 ：配制后7天,11986660 018/11986651 018 因子法大包裝DBILI 大包裝 ACN659改良JG法,比色法 樣本加入R1， 加入 R2 并開始反應：重氮化對氨基苯磺酸（對氨基苯磺酸與酸化亞硝酸鈉反應產生）與膽紅素反應形成偶氮膽紅素。在直接膽紅素檢測中，僅有結合膽紅素與重氮化對氨基苯磺酸反應。 膽紅素+重鹽離子 偶氮膽紅素 所形成的紅色偶氮染料的顏色強度與

26、直接（結合）膽紅素濃度成正比，可采用光度計進行測量。 試劑-工作溶液 R1鹽酸：50mmol/L R2對氨基苯磺酸：25.7 mmol/L；鹽酸70 mmol/L,亞硝酸鈉：2.7 mmol/L，碳酸氫鈉13.9mmol/L 穩(wěn)定性：R1 ：即用型至有效期，R2:配制后14天 因子法：使用mg/dL單位 保留兩位小數 K因子=2510 理論因子：使用umol/L單位，保留一位小數 2510X17.1/10= 4292.1 ，經驗設置成5500,05589037 190新一代直膽試劑盒BILD2 ACN 734改良間氨基苯磺酸法,檢測原理 重氮化間氨基苯磺酸（間氨基苯磺酸與酸化亞硝酸鈉反應產生）

27、與膽紅素反應形成偶氮膽紅素。在直接膽紅素檢測中，僅有結合膽紅素與重氮化對氨基苯磺酸反應。 膽紅素+重鹽離子 偶氮膽紅素 所形成的紅色偶氮染料的顏色強度與直接（結合）膽紅素濃度成正比，可采用光度計進行測量。 試劑-工作溶液 R1磷酸：85mmol/L，HEDTA: 4.0 mmol/L，NaCl: 50 mmol/L;表面活性劑pH 1.9 R23.5間氨基苯磺酸：1.5 mmol/L；pH 1.3 穩(wěn)定性 ：R1:即用型6周，R2即用型：6周,物質對光的選擇性吸收吸收互補光,溶液之所以呈現不同的顏色，是與它對光的選擇性吸收有關。當一束白光（由各種波長的色光按一定比例組成）通過一有色溶液時，某些波長的光被溶液吸收。另一些波長的光不被吸收而透過溶液。 溶液的顏色由透過光波長所決定。如CuSO4溶液強烈地吸收黃色的光，所以溶液呈現藍色。 如溶液對白光中各種顏色的光都不吸收，則溶液為透明無色，反之，則呈黑色。 如果兩種顏色的光按適當的強度比例混合后組成白光，則這