1、8 維生素的測定,維生素是維持人體正常生命活動所必需的一類天然有機化合物。其種類很多，目前已確認的有30余種，其中被認為對維持人體健康和促進發(fā)育至關(guān)重要的有20余種。這些維生素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化性質(zhì)及生理功能各異，有的屬于醇類，有的屬于胺類，有的屬于酯類，還有的屬于酚或醌類化臺物。,維生素都具有以下共同特點： 這些化合物或其前體化合物都在天然食物中存在；它們不能供給機體熱能。也不是構(gòu)成組織的基本原料，主要功用是通過作為輔酶的成份調(diào)節(jié)代謝過程，需要量極小；它們一般在體內(nèi)不能合成，或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝?。婚L期缺乏任何一種維生素都會導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。,我們在評價食品的營養(yǎng)價值，開發(fā)

2、利用高含量維生素的食品資源，指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，指導(dǎo)制定加工工藝或貯存條件，最大限量地保留各種維生素，還要控制強化食品中加入量，防中毒，都離不開分析檢測工作。 維生素分類：脂溶性（A、D、E、K） 水溶性兩類（B族、C）,一、 脂溶性V的測定,VA、VD、VE與類脂物一起存于食物中，攝食時可吸收，可在體內(nèi)積貯。 脂溶性維生素具有以下理化性質(zhì)： 1溶解性：脂溶性維生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機溶劑。 2耐酸堿性：維生素A、D對酸不穩(wěn)定， 對堿穩(wěn)定，維生素E對堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰性氣體保護下，也能經(jīng)受堿的煮沸。,3耐熱性、耐氧化性： 耐熱性 氧化性 V

3、A 好，能經(jīng)受煮沸 易被氧化 （光、熱促進其氧化） V D 好，能經(jīng)受煮沸 不易被氧化 V E 好，能經(jīng)受煮沸 在空氣中能慢慢被化 （光、熱、堿促進其氧化）,根據(jù)上述性質(zhì)測定脂溶性維生素時，通常： 皂化樣品 水洗去除類脂物 有機溶劑提取脂溶性維生素(不皂化物) 濃縮 溶于適當?shù)娜軇?測定。 在皂化和濃縮時，為防止維生素的氧化分解，常加入抗氧化劑(如焦性沒食子酸、維生素C等)。 對于A、D、E共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，在皂化提取后，還需進行層析分離。,一、維生素A的測定 維生素A存在于動物性脂肪中，主要來源于肝臟、魚干油、蛋類、乳類等動物性食品中。植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡

4、蘿卜素，它在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)閂A，故稱為VA原。,高效液相色譜法測定食物中VA、VC （GB 5009.822016中第一法） 高效液相色譜法測定維生素A是近幾年發(fā)展起來的方法，此法能快速分離和測定視黃醇和它的同分異構(gòu)體、酯及其衍生物。,三氯化銻光度法測定VA的含量 （一） 原理 在氯仿溶液中，維生素A與三氯化銻可相互作用，生成藍色可溶性配合物，其顏色深淺與溶液中所含維生素A的含量成正比。該物質(zhì)在620nm波長處有最大吸收峰，其吸光度與維生素A的含量在一定的范圍內(nèi)成正比，故可比色測定。,（二）適用范圍及特點 本法適用于維生素A含量較高的各種樣品(高于 510 g g )，對低含量樣品，因受其他脂

5、溶性物質(zhì)的干擾不易比色測定. 該法的主要缺點是生成的藍色絡(luò)合物的穩(wěn)定性差。比色測定必須在 ，否則藍色會迅速消退，將造成極大誤差。,6秒鐘內(nèi)完成,（三）注意： 1. 維生素A見光易分解，整個實驗應(yīng)在暗處進行，防止陽光照射，或采用棕色玻璃避光。 2. 三氯化銻腐蝕性強，不能沾在手上，三氯化銻遇水生成白色沉淀因此用過的儀器要先用稀鹽酸浸泡后再清洗。 3.乙醚為溶劑的萃取體系，易發(fā)生乳化現(xiàn)象。在提取、洗滌操作中，不要用力過猛，若發(fā)生乳化，可加幾滴乙醇破乳。,4. 由于三氯化銻與維生素A所產(chǎn)生的藍色物質(zhì)很不穩(wěn)定，通常生成6S后便開始褪色，因此要求反應(yīng)在比色管中進行，產(chǎn)生藍色后立即讀取吸光度。 5. 如果

6、樣品中含-胡蘿卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干擾測定，可將濃縮蒸干的樣品用正己烷溶解，以氧化鋁為吸附劑，丙酮、乙烷混合液為洗脫劑進行柱層析。 6. 比色法除用三氯化銻做顯色劑外，還可用三氟乙酸、三氯乙酸做顯色劑。其中三氟乙酸沒有遇水發(fā)生沉淀而使溶液混濁的缺點。,二、胡蘿卜素的測定,胡蘿卜素是一種廣泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多種異構(gòu)體和衍生物，總稱為類胡蘿卜素，其中在分子結(jié)構(gòu)中含有 一紫羅寧殘基的類胡蘿卜素，在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A，故稱為維生素A原。如、胡蘿卜素，其中以胡蘿卜素效價最高。,胡蘿卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡蘿卜為食物的家禽、獸類、水產(chǎn)動物及其加工產(chǎn)品，以及為著色

7、而添加胡蘿卜素的食品，當然也含有胡蘿卜素。,胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)如下：,胡蘿卜素對熱及酸、堿比較穩(wěn)定，但紫外線和空氣中的氧可促進其氧化破壞。因系脂溶性維生素，故可用有機溶劑從食物中提取。 胡蘿卜素本身是一種色素，在450 nm 波長處有最大吸收，故只要能完全分離，便可定性和定量。但在植物體內(nèi)，胡蘿卜素經(jīng)常與葉綠素、葉黃素等共存，在提取 一胡蘿卜素時，這些色素也能被有機溶劑提取，因此在測定前，必須將胡蘿卜素與其它色素分開。常用的方法有紙層析、柱層析和薄層層析法。,紙層析法 1.原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡蘿卜素及其他植物色素。以石油醚為展開劑進行紙色譜，胡蘿卜素極性最小，移動速度最快，從而與其他

8、色素分離。剪下含胡蘿卜素的區(qū)帶，洗脫后于450nm波長下定量測定。,說明及注意事項 （1）此法所測結(jié)果為總胡蘿卜素含量，在食品中以-胡蘿卜素的含量比例最高，只有少數(shù)食品如胡蘿卜、紫菜等含有-胡蘿卜素和-胡蘿卜素。因此一般測定的胡蘿卜素僅指-胡蘿卜素。 （2）胡蘿卜素易被陽光破壞，應(yīng)在較暗的環(huán)境下操作。,三、維生素D的測定,維生素D是指含有抗佝僂病活性的一類物質(zhì)，具有維生素D活性的化合物約有l(wèi) 0種，其中最重要的是維生素D2、維生素D 3及其維生素D原。維生素D 2無天然存在，維生素D2只存在于某些動物性食物中。但它們都可由維生素D原(麥角固醇和7一脫氫膽固醇)經(jīng)紫外線照射形成。 維生素D2 藥

9、片吃多了中毒。,維生素D的測定三氯化銻比色法（AOAC法）,1原理 維生素D與三氯化銻在三氯甲烷中產(chǎn)生橙黃色化合物，并在500nm波長處有之大吸收，呈色強度與維生素D的含量成正比。加入乙酰氯可以消除溫度、濕度等干擾因素的影響。維生素A和D共存時，須先用柱層析分離，去除維生素A，再比色測定。 2試劑 3操作步驟 （1）樣品處理 分離柱的制備。如圖所示。 純化。,圖 層析裝置,（2）測定 標準曲線的繪制。 樣品測定。 4結(jié)果計算 式中 x樣品中維生素D的含量，mg100g； c標準曲線上查得樣品溶液中維生素D的含量，gmL；(如按國際單位，每國際單位0.025g維生素D)； V樣品提取后用三氯甲烷

10、定容之體積，mL； m樣品質(zhì)量。,5說明及注意事項 （1）食品中維生素D的含量一般很低，而維生素A、維生素E、膽固醇、速甾醇等成分的含量往往都大大超過維生素D、嚴重干擾維生素D的測定，因此測定前必須經(jīng)柱層析除去這些干擾成分。 （2）操作時加入乙酰氯可以消除溫度的影響，可使靈敏度比僅用三氯化銻提高約3倍，并可減少部分甾醇的干憂。 （3）此法不能區(qū)分維生素D2和維生素D3，測定值是兩者的總量。,四、維生素E的測定比色法 1原理 維生素E能將高鐵離子還原為低鐵離子，低鐵離子與，-聯(lián)氮苯發(fā)生顏色反應(yīng)，可以進行比色測定。 2試劑 3操作步驟 （1）樣品處理 皂化；純化。 （2）樣品測定 （3）標準曲線的

11、繪制 4計算結(jié)果 同維生素A的測定。1國際單位維生素E相當于1.1mg-維生素E。,5說明及注意事項 （1）在皂化時，用氮氣流保護，也可加入焦性沒食子酸作為抗氧化劑，防止維生素E的氧化。 （2）此法反應(yīng)沒有特異性，故處理前應(yīng)將其他還原性物質(zhì)除去。 （3）也可采用4，7-二苯基-1，10-菲繞啉作為發(fā)色劑，其靈敏度比，-聯(lián)吡啶高2.4倍。 （4）維生素E的各種異構(gòu)體與試劑的反應(yīng)速度、呈色強度各不相同。 （5）由于光能促進維生素E氧化，因此盡可能避光操作。,二、 水溶性維生素的測定,水溶性維生素B1、B2和C，廣泛存在于動植物組織中，飲食來源充足。但是由于它們本身的水溶性質(zhì)，除滿足人體生理、生化作

12、用外，任何多余量都會從小便中排出。為避免耗盡，需要經(jīng)常地由飲食來提供。,水溶性維生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機溶劑。在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定，既使加熱也不破壞；但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解，特別在堿性條件下加熱，可大部或全部破壞。它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響； 維生素B2對光，特別是紫外線敏感，易被光 線破壞； 維生素C對氧、銅離子敏感，易被氧化。,根據(jù)上述性質(zhì)，測定水溶性維生素時，一般都在酸性溶液中進行前處理。,維生素Bl、B2 鹽酸水解 酶解 提取 純化 維生素C通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定濃度的酸性介質(zhì)中，可以消除某些還原性雜質(zhì)對維

13、生素C的破壞作用。,（一）維生素Bl的測定,維生素Bl又名硫胺素、抗神經(jīng)炎素，通常以游離態(tài)，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麥胚、花生、黃豆以及綠色蔬菜和牛乳、蛋黃中含量較為豐富。 分析方法：GB 5009.84-2016中的方法是高效液相色譜法和熒光法。,說明及注意事項 （1）凡士林具有熒光，涂在活塞上會帶來污染，可用甘油-淀粉潤滑劑代替凡士林。 （2）一般樣品中的維生素有游離型的，也有結(jié)合型的，故需要用酸和酶水解，使結(jié)合型化為游離型的，然后再用本法測定。 （3）谷類物質(zhì)不需酶分解，樣品粉碎后用酸性KCl直接提取、氧化測定。 （4）淀粉酶不需要配成溶液，以免因保存時間長而失去活力

14、。 （5）鐵氰化鉀的用量要適當，過多會破壞硫胺素，過少則硫胺素氧化不完全。 （6）氧化是操作的關(guān)鍵步驟，操作中應(yīng)保持加試劑的速度一致。,（二）維生素B2的測定,維生素B2即核黃素。在食品中以游離形式或磷酸酯等結(jié)合形式存在。膳食中的主要來源是各種動物性食品，其中以肝、腎、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆類和新鮮綠葉蔬菜。 分析方法： GB 5009.85-2016中 第一法為高效液相色譜法。 第二法為熒光分光光度法。,直接熒光法（低二硫酸鈉熒光法） 原理 核黃素在440500nm波長光照射下產(chǎn)生黃綠色熒光。在稀溶液中其熒光強度與核黃素的濃度成正比，在波長525nm下測定其熒光強度。試液加

15、入連二硫酸鈉，將核黃素還原為無熒光的物質(zhì)，然后再測定試液中殘余熒光物質(zhì)的熒光強度，兩者之差即為食品中核黃素所產(chǎn)生的熒光強度。色素干擾可用高錳酸鉀氧化除去。,說明及注意事項 本法適用于糧食、蔬菜、調(diào)料、飲料等脂肪含量少的樣品，脂肪含量過高及含量較多不易除去色素的樣品不適用。 酶解的目的是為了使結(jié)合型的維生素B2轉(zhuǎn)化為游離型的維生素B2。 核黃素對光敏感，因此操作應(yīng)盡可能在暗室進行。,（三） 維生素C（抗壞血酸）的測定,維生素C是一種己糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以又稱作抗壞血酸。新鮮的水果蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、獼猴桃、柑橘等食品中含量尤為豐富。 測定維生素C常用的方法有靛酚滴定法、苯肼比

16、色法、熒光法和高效液相色譜法等。,（1）2，6-二氯靛酚滴定法,1原理 還原型抗壞血酸可以還原染料2，6-二氯靛酚。該染料在酸性溶液中呈粉紅色(在中性或堿性溶液中呈藍色)，被還原后顏色消失。還原型抗壞血酸還原染料后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時，一定量的樣品提取液還原標準染料液的量，與樣品中抗壞血酸含量成正比。,2. 說明, 所有試劑最好用重蒸餾水配制。 樣品采取后，應(yīng)浸泡在已知量的2%草酸溶液中，以防止維生素C氧化損失。測定時整個操作過程要迅速，防止抗壞血酸被氧化。 若測動物性樣品，須用10%三氯乙酸代替2%草酸溶液提取。 若樣品濾液顏色較深，影響滴定終點觀察，可加入白陶土再過濾。白陶土使用前應(yīng)測定回收率。 若樣品中含有Fe2+、Cu2+、Sn2+、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等還原性雜質(zhì)時，會使結(jié)果偏高。,(三)熒光法 GB 5009.86-2016 第二法 1.原理 樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化成脫氫型抗壞血酸后，與鄰苯二胺（OPDA）反應(yīng)生成具有熒光的喹喔啉，其熒光強度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測定食物中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。 脫氫抗壞血酸與硼酸可形成復(fù)合物而不與OPDA反應(yīng)，以此排除樣品中熒光雜質(zhì)所產(chǎn)生的干擾。 本方法的最小檢出限為0.022g/m