1、基因信息的傳遞,基因：編碼生物活性產(chǎn)物的DNA功能片段,基因三大特征： 攜帶遺傳信息 能被復制 能突變,復制,翻譯,蛋白質(zhì) （病毒）,RNA （病毒）,逆轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄,RNA,翻譯,蛋白質(zhì),DNA,復制,中心法則（The central dogma）,DNA的生物合成 (復制) DNA Biosynthesis，Replication,第 12 章,復制(replication) 指遺傳物質(zhì)的傳代，以親代DNA為模板，dNTP (dATP dGTP dCTP dTTP)為原料，按堿基配對規(guī)律合成子代DNA的過程。,復制的基本規(guī)律 Basic Rules of DNA Replication,第一

2、節(jié),一、半保留復制 (semi-conservative replication),子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式,密度梯度實驗,DNA半保留復制模型,按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。,半保留復制的意義,遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。,原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉(replication fork) 。,二、雙向復制 (bidirectional replication),A. 環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點 B. 復制中的兩個復制叉

3、C. 復制接近終止點(termination, ter),三、復制的半不連續(xù)性 (semi-discontinuous replication),領(lǐng)頭鏈 (leading strand),隨從鏈 (lagging strand),半不連續(xù)性 復制過程中，領(lǐng)頭鏈連續(xù)復制，而隨從鏈不連續(xù)復制的現(xiàn)象。 岡崎片段(okazaki fragment) 不連續(xù)復制的片段,參與DNA復制的物質(zhì),模板(template) : 解開成單鏈的DNA母鏈 底物(substrate): dNTP DNA聚合酶(polymerase): 簡寫為 DNA-pol RNA引物(primer): 提供3-OH使dNTP聚合

4、其他的酶和蛋白質(zhì)因子,一、復制的化學反應(yīng),目 錄,磷酸二酯鍵的生成,+dN2TP,+PPi,DNA pol,聚合反應(yīng)的特點：,聚合,新鏈的延長只可沿53方向進行。,DNA新鏈生成需引物和模板；,全稱：依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase, DDDP) 簡稱：DNA-pol,活性：1. 53 聚合活性 2. 核酸外切酶活性,二、DNA聚合酶,DNA-pol 的 53聚合作用,15/62,35外切,5 3外切,5,3,內(nèi)切酶(Endonuclease) （限制性內(nèi)切酶）,35外切,5 3外切(Exonuclease),外切酶與內(nèi)切酶作用圖解,16/6

5、2,1. 原核生物的DNA聚合酶,共同點：1. 53 的聚合活性 2. 35 外切酶活性,DNA-pol,DNA-pol ,DNA-pol ,功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和 修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。,DNA-pol （109kD）,DNA-pol I 5 3外切酶活性的功能,切除引物，切除突變片段,17/62,DNA-pol I 35外切酶活性的功能,校讀（proofread）功能,17/62,323個氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604個氨基酸,DNA聚合酶活性 5核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是實驗室合成DNA

6、，進行分子生物學研究中常用的工具酶。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因發(fā)生突變，細菌依 然能存活。 它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復。,功能: 是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD),DNA-po l 同時合成領(lǐng)頭鏈和隨從鏈,段,2. 真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引發(fā)，有引物酶活性。,延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。,參與低保真度的復制。,在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。,僅存在于線粒體DNA復制中。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,三、復制的保真性 (fidelity

7、),1. 遵守嚴格的堿基配對規(guī)律,2. 聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能,DNA pol 靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(氫鍵)與共價鍵(磷酸二酯鍵) 的有序形成。 嘌呤的化學結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對時，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。,DNA pol III 在催化磷酸二酯鍵形成之前完 成對堿基的選擇；對反式嘌呤核苷酸的親和 力較順式的大。,3. DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀,A：DNA-pol 的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。 B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。,解鏈酶類：,解螺旋酶,拓撲異構(gòu)酶,單鏈DNA結(jié)合蛋白,四、復制中的解

8、鏈和DNA分子拓撲學變化,引物酶,1. 解螺旋酶 (helicase),作用：斷裂互補堿基間的氫鍵，使DNA成單鏈。,DnaA、B (rep蛋白、解螺旋酶)、C等,解螺旋酶,ATP,2. 單鏈DNA結(jié)合蛋白 (single stranded DNA-binding protein, SSB),作用：防止單鏈DNA重新形成雙鏈，防止 單鏈DNA被核酸酶水解。,3. 引物酶 (primase),催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一種特殊的RNA聚合酶。,DNA合成需在RNA引物的基礎(chǔ)上進行。,4. DNA拓撲異構(gòu)酶 (topoisomerase, Topo),DNA正超螺旋與負超螺旋,負超螺旋,

9、正超螺旋,DNA雙螺旋,拓撲異構(gòu)酶,解鏈過程中正超螺旋的形成,解鏈過程中正超螺旋的形成,拓撲異構(gòu)酶作用特點 既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵,拓撲異構(gòu)酶 拓撲異構(gòu)酶,分 類,切割DNA雙鏈，此時不需ATP；爾后由ATP供能，使DNA分子成負超螺旋再連接切口。,不需ATP，切割雙鏈DNA中的一鏈，使DNA松弛后, 連接切口。,Topo:,Topo:,臨床上使用的某些抗腫瘤藥（如喜樹堿，鬼臼乙叉甙等）是通過抑制Topo酶活性而殺死腫瘤細胞的。,作用機制,五、DNA連接酶 (DNA ligase),作用方式,催化DNA雙鏈的3羥基和相鄰的5磷酸基團形成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連成完整的鏈。

10、,DNA連接酶,ATP,ATP,HO,5,3,3,5,DNA連接酶,ATP,AMP+PPi,5,3,5,3,目 錄,在復制中起最后接合缺口的作用； 在DNA修復、重組及剪接中起縫合缺口作用； 基因工程的重要工具酶之一。,功能,參與DNA復制的主要成員,主要成員,主要作用,DnaA,DnaB (解螺旋酶),SSB,DnaG (引物酶),TOPO,DNA-pol ,DNA-pol,DNA連接酶,DnaC,識別復制起始位點,解開DNA雙鏈,運送和協(xié)同DnaB,合成RNA引物,維持已解開單鏈DNA的穩(wěn)定,使打結(jié)、纏繞、正超螺旋的DNA松馳,DNA復制,水解引物、填補空隙、修復作用,催化雙鏈DNA中單鏈

11、缺口的連接,DNA生物合成過程 The Process of DNA Replication,第三節(jié),復制的起始 復制的延長 復制的終止,（一）復制的起始 (initiation ),需要解決兩個問題：,1. DNA解開成單鏈，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,由特定蛋白質(zhì)識別復制起始位點(ori)，在解螺旋酶、TOPO酶及單鏈DNA結(jié)合蛋白的共同作用下，DNA解鏈，解旋，形成復制叉。,倒Y,1. DNA解鏈,E.coli復制起始點 oriC,E.coli復制起始點oriC跨度為245bp， 有3組串聯(lián)重復序列和2對反向重復序列。,E.coli復制起

12、始點 oriC,Dna A,SSB,復制叉的形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。,2. 引發(fā)體的生成,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。,引物,引物酶,3. RNA引物合成,（二）復制的延長 (elongation),復制的延長指在DNA-pol 催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。,3AAGACCTATT5,5TTCTGGATAA3,dATP,+,DNA pol,OH 3,3,領(lǐng)頭鏈的合成,隨從鏈的合成,階段一,階段二,階段三,階段四,1. 原核生物基因是環(huán)狀DNA

13、，雙向復制的 匯合點就是復制的終止點。,（三）復制的終止,2. 領(lǐng)頭鏈上的RNA引物被RNA酶水解后， 由DNA pol I 催化，由新合成鏈提供 3-OH補齊。,3. 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接,真核生物每個染色體是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活。 復制的起始需要DNA-pol和pol參與。還需拓撲酶和復制因子 (replication factor, RF)。 增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在復制起始和延長中起關(guān)鍵作用。,（一）復制的起始,二、真核生物的DNA生物合成,領(lǐng)頭鏈,隨從鏈,（二）復制的延長,

14、染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。 復制中岡崎片段的連接，復制子之間的 連接。 染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA 引物，去除后留下空隙。,（三）復制的終止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,5,染色體復制危機,反轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase),反轉(zhuǎn)錄 (reverse transcription)現(xiàn)象,一、反轉(zhuǎn)錄病毒和反轉(zhuǎn)錄酶,又稱為逆轉(zhuǎn)錄酶，為依賴RNA的DNA聚合酶， (RNA-dependent DNA polymerase, RDDP),反轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，有三種酶活性：,1. 反轉(zhuǎn)錄活性：即以RNA為模板合成DNA,2.

15、RNase活性：水解RNA:DNA中的RNA,3. DNA pol活性：以DNA為模板合成DNA,反轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄過程,分子生物學研究可應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。,以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。,試管內(nèi)合成cDNA,cDNA complementary DNA,二、反轉(zhuǎn)錄研究的意義,反轉(zhuǎn)錄酶和反轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。 反轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。 對反轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。,三、端粒酶,端粒(telomere)

16、,指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu),對外: 抵御核酸酶等外界 因素的襲擊,保護染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性,染色體,對內(nèi): 染色體DNA的 末端復制問題,結(jié)構(gòu)特點,由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。 末端DNA序列是多次重復的富含T、G 堿基的短序列。,端粒酶 (telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶協(xié)同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT),組成:,作用：,填補

17、子鏈5 -末端引物水解后留下的空隙，防 止DNA縮短。,端粒酶催化作用的爬行模型,端粒酶催化作用的爬行模型,正常細胞：,細胞分裂,細胞分裂,衰老死亡,細胞年輕化,抗衰老,端粒、端粒酶與細胞衰老,約85%的腫瘤組織有端粒酶活性; 癌細胞在某些機制的作用下啟動端粒酶表達而使染色體端粒穩(wěn)定地維持在一定長度; 從而使癌細胞得以持續(xù)增殖、轉(zhuǎn)移并獲得永生。,端粒、端粒酶與腫瘤,遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變 (mutation)。,在復制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷 (DNA damage)。,從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。,一、突變的意義,（一）突變是進化

18、、分化的分子基礎(chǔ) （二）突變導致基因型改變 （三）突變導致死亡 （四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ),二、引發(fā)突變的因素,物理因素: 紫外線 (ultra violet, UV)、各種輻射,UV,化學因素,三、突變的分子改變類型,錯配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement),DNA分子上的堿基錯配又稱點突變 (point mutation),發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,轉(zhuǎn)換,發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。,顛換,（一）錯配,鐮形紅細胞貧血病人Hb (HbS) 亞基,正常成人Hb (HbA)亞基,（二）缺失、插入和框移突變,缺