1、第七章 外源化學(xué)物質(zhì)突變作用,衛(wèi)生毒理學(xué)教研室 2004.5,2,遺傳毒理學(xué),第一節(jié) 基本概念 第二節(jié) 化學(xué)毒物致突變的類型 第三節(jié) 致突變作用機(jī)制和后果 第四節(jié) 機(jī)體對(duì)致突變作用的影響 第五節(jié) 觀察化學(xué)毒物致突變作用 的基本方法,3,基本概念,遺傳毒理學(xué)(Genetic Toxicology) 是毒理學(xué)的一個(gè)分支，研究外源化學(xué)物及其他環(huán)境因素對(duì)生物體遺傳機(jī)構(gòu)的損害作用及其規(guī)律。其主要目的是檢測(cè)那些能引起DNA損傷的環(huán)境因素，研究其遺傳毒作用的特點(diǎn)及對(duì)人類的潛在危害。,4,基本概念,突變(mutation) 遺傳結(jié)構(gòu)本身的變化及其引起的變異稱為突變，突變實(shí)際上是遺傳物質(zhì)的一種可遺傳的變異。 自

2、發(fā)突變(spontaneous mutation) 由于自然界中誘變劑的作用或由于偶然的自制、 轉(zhuǎn)錄、修復(fù)時(shí)的堿基配對(duì)錯(cuò)誤所產(chǎn)生的突變。 誘發(fā)突變(induced mutation) 誘變劑誘發(fā)的突變。,5,致突變作用或誘變作用(mutagenesis) 廣義概念是外來(lái)因素，特別是化學(xué)因子引起細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的能力，而且此種改變可隨同細(xì)胞分裂過(guò)程而傳遞。簡(jiǎn)單地說(shuō)，突變的發(fā)生及其過(guò)程即為致突變作用。 化學(xué)誘變劑(chemical mutagen) 基因突變(gene mutation) 一個(gè)或幾個(gè)DNA堿基對(duì)的改變 染色體畸變(chromosome aberration) 染色體的結(jié)構(gòu)

3、及數(shù)目改變,基本概念,6,DNA與基因: 基因(gene) 基因組(genosome) 染色質(zhì)(chromatin)與染色體(chromosome) 體細(xì)胞(somatic cell)和生殖細(xì)胞(germ cell) 基因型(genotype)與表型(pheotype) 細(xì)胞周期(cell cycle)、有絲分裂(mitosis)與減數(shù)分裂(meiosis),基本概念,7,基本概念,8,基本概念,9,基本概念,10,基本概念,11,基因突變（gene mutation） 染色體畸變（chromosome aberration） 非整倍體和多倍體 (aneuploidy and polyloid

4、),化學(xué)毒物致突變的類型,12,化學(xué)毒物致突變的類型,一、基因突變(gene mutation) 1堿基置換(basepair substitution) 指某一堿基配對(duì)性能改變或脫落所致的突變。 轉(zhuǎn)換(transition) 顛換(transvertion) 2移碼突變 (frameshift mutation) 指發(fā)生一對(duì)或幾對(duì)（三對(duì)除外）的堿基減少或增加，以致從受損點(diǎn)開始?jí)A基序列完全改變，形成錯(cuò)誤的密碼，并轉(zhuǎn)譯成為不正常的氨基酸。,13,一、基因突變(gene mutation),化學(xué)毒物致突變的類型,14,化學(xué)毒物致突變的類型,一、基因突變(gene mutation),15,二、染色

5、體畸變(chromosome aberration) 指染色體的結(jié)構(gòu)改變 染色單體型畸變(chromatid-type aberration) 染色體型畸變(chromosome aberration),化學(xué)毒物致突變的類型,16,染色體缺失及環(huán)狀染色體的形成圖,染色體插入和重復(fù)示意圖,17,染色體的臂間倒位,染色體相互易位示意圖,18,二、染色體畸變(chromosome aberration),化學(xué)毒物致突變的類型,19,三、基因組突變 1非整倍體 非整倍體(aneuploid)指細(xì)胞丟失或增加一條或幾條染色體。缺失一條染色體時(shí)稱為單體(monosome)，增加一條染色體時(shí)稱為三體(tri

6、some)。染色體數(shù)目的改變會(huì)導(dǎo)致基因平衡的失調(diào)，可能影響細(xì)胞的生存或造成形態(tài)及功能上的異常。如21三體導(dǎo)致先天愚型(Down氏綜合征)。 2整倍體 整倍體(euploid)指染色體數(shù)目的異常是以染色體組為單位的增減，如形成三倍體(triploid)、四倍體(tetroploid)等。在人體，3n為69條染色體，4n為92條染色體。在腫瘤細(xì)胞及人類自然流產(chǎn)的胎兒細(xì)胞中可有三倍體細(xì)胞的存在。發(fā)生于生殖細(xì)胞的整倍體改變，幾乎都是致死性的。,化學(xué)毒物致突變的類型,20,致突變作用的機(jī)制,一、DNA損傷與突變 (一)堿基損傷 1. 堿基錯(cuò)配 2. 嵌入DNA鏈 3. 堿基類似物的取代 4. 堿基的化學(xué)

7、結(jié)構(gòu)改變或破壞,21,一、DNA損傷與突變 （二）DNA鏈?zhǔn)軗p 1. 二聚體的形成 2. DNA加合物（DNA adducts）形成 3. DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物(DNA-Protein crosslinks，DPC)形成 二、引起突變的細(xì)胞分裂過(guò)程的改變 三、其他的改變 對(duì)DNA合成和修復(fù)有關(guān)的酶系統(tǒng)作用可間接導(dǎo)致 DNA損傷，誘發(fā)基因突變或染色體畸變。,致突變作用的機(jī)制,22,突變的不良后果,23,一、機(jī)體修復(fù)DNA損傷的機(jī)制可分為兩大類： 1.損傷耐受機(jī)制：指DNA遺傳可繞過(guò)那些阻止DNA 復(fù)制的DNA損傷。 2. 修復(fù)機(jī)制：,DNA修復(fù),直接修復(fù),切除修復(fù),O6甲基鳥嘌呤修復(fù),光修復(fù),錯(cuò)

8、配堿基修復(fù),堿基切除修復(fù),核苷酸切除修復(fù),機(jī)體對(duì)致突變作用的影響,復(fù)制后修復(fù),呼救性修復(fù),24,機(jī)體對(duì)致突變作用的影響,二、遺傳因素對(duì)致突變作用的影響： (一)代謝酶遺傳多態(tài)性 (二)修復(fù)功能的個(gè)體差異,25,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,一、觀察項(xiàng)目的選擇 1觀察的效應(yīng)終點(diǎn)類型 基因突變和染色體畸變的檢測(cè)可直接反映化學(xué)毒物的致突變性，是評(píng)價(jià)化學(xué)毒物致突變性唯一可靠的方法。還有許多試驗(yàn)所觀察到的現(xiàn)象并不反映基因突變、染色體畸變和染色體分離異常，而僅反映致突變過(guò)程中發(fā)生的其他事件。因此，將試驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象所反映的各種事件統(tǒng)稱為遺傳學(xué)終點(diǎn)(genetic endpoint)。,26,觀察化學(xué)毒

9、物致突變作用的基本方法,一、觀察項(xiàng)目的選擇 遺傳學(xué)終點(diǎn)分為5類： DNA完整性的改變(形成加合物，斷裂，交聯(lián))； DNA重排或交換； DNA堿基序列改變； 染色體完整性改變； 染色體分離改變。 其中實(shí)際上指基因突變，指染色體畸變。,27,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,2成套的觀察項(xiàng)目 遺傳毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序通常為一組體內(nèi)、外遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)。因?yàn)椋?化學(xué)毒物的種類和結(jié)構(gòu)多種多樣，其致突變的機(jī)制不盡相同，作用的靶細(xì)胞也不一樣，有的是體細(xì)胞，或生殖細(xì)胞，或兩者兼而有之，故在成套觀察項(xiàng)目中既要用體細(xì)胞檢測(cè)又要用生殖細(xì)胞；除了從分子水平還要從細(xì)胞水平來(lái)檢測(cè)化學(xué)毒物的遺傳毒性。 致突變物中僅少數(shù)具有直接致

10、突變作用，大多數(shù)為間接致突變作用，即需要在體內(nèi)代謝活化后，才具有致突變作用。體內(nèi)試驗(yàn)具有完整的活化系統(tǒng)，而體外試驗(yàn)則通過(guò)加入模擬代謝系統(tǒng)，如S9來(lái)彌補(bǔ)缺乏活化系統(tǒng)的不足。這是體內(nèi)與體外試驗(yàn)的主要差別。 化學(xué)毒物的致突變性有強(qiáng)，也有弱；有的在某一檢測(cè)系統(tǒng)中是強(qiáng)致突變物，而在另一系統(tǒng)中可能是弱的致突變物。對(duì)于弱致突變物在某些系統(tǒng)中比較容易漏檢，即出現(xiàn)假陰性。,28,2成套的觀察項(xiàng)目 關(guān)于遺傳毒理學(xué)成套觀察項(xiàng)目中那些試驗(yàn)可入選的原則有： 選擇的遺傳毒性試驗(yàn)應(yīng)包括5種類型的遺傳學(xué)終點(diǎn)。 通常的實(shí)驗(yàn)材料有病毒、細(xì)菌、真菌、培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞、植物、昆蟲及哺乳動(dòng)物等。 體內(nèi)試驗(yàn)與體外試驗(yàn)配合。 應(yīng)包括生殖細(xì)胞

11、和體細(xì)胞。 通常，對(duì)于一種受試物應(yīng)當(dāng)先用原核細(xì)胞或體細(xì)胞的體外試驗(yàn)按遺傳學(xué)終點(diǎn)合理配套進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)有陽(yáng)性結(jié)果的遺傳學(xué)終點(diǎn)驗(yàn)證其在體內(nèi)的真實(shí)性，再行選用生殖細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)進(jìn)行遺傳危害的評(píng)價(jià)。,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,29,二、常用的致突變?cè)囼?yàn) (一)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn)),鼠傷寒沙門氏菌原養(yǎng)型(his+),組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。(his-),正向突變,回復(fù)突變,代謝活化系統(tǒng),受試物,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,30,二、常用的致突變?cè)囼?yàn) (二)微核試驗(yàn) 微核(Micronucleus)的產(chǎn)生與染色體損傷有關(guān)，是染色體或染色單體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片或紡錘絲受損傷而丟失的整個(gè)

12、染色體，在細(xì)胞分裂后期遺留在細(xì)胞質(zhì)中，末期之后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱微核。在細(xì)胞質(zhì)中微核來(lái)源有二：斷片或無(wú)著絲粒染色體在細(xì)胞分裂后期不能定向移動(dòng)，而遺留在細(xì)胞質(zhì)中；有絲分裂毒物的作用使個(gè)別染色體或帶苔絲粒的染色體環(huán)和斷片在細(xì)胞分裂后期被留在細(xì)胞質(zhì)中。微核試驗(yàn)(Micronucleus test，MNT)是觀察受試物能否產(chǎn)生微核的試驗(yàn)。其主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑。,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,31,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,(二)微核試驗(yàn),32,MN,NCE,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,33,二、常用的致突變?cè)囼?yàn)

13、(三)染色體畸變分析 (四)姐妹染色單體交換試驗(yàn)（SCE）,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,34,二、常用的致突變?cè)囼?yàn) (五)果蠅伴性隱性致死試驗(yàn) (六)顯性致死試驗(yàn) (七)程序外DNA臺(tái)成試驗(yàn) (八)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致突變?cè)囼?yàn) (九)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn),觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,35,三、致突變?cè)囼?yàn)中的一些問(wèn)題 (一)陰性和陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)立 1陰性對(duì)照 它是空白對(duì)照，即不加任何處理。或者是溶劑對(duì)照。陰性對(duì)照除了無(wú)處理因素外，與實(shí)驗(yàn)組完全相同。其目的是獲得實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。例如，Ames試驗(yàn)的陰性對(duì)照可了解所用的細(xì)菌的自發(fā)回復(fù)突變率；證實(shí)除處理因素外無(wú)任何使回復(fù)突變率增加或減少的因素。

14、2陽(yáng)性對(duì)照 是用某種已知能產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)的物質(zhì)作為對(duì)照。其目的是通過(guò)對(duì)陽(yáng)性物質(zhì)的試驗(yàn)證明實(shí)驗(yàn)方法的可靠；驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)者在本實(shí)驗(yàn)條件下，完成技術(shù)和鑒定致突變物的能力；證實(shí)經(jīng)一段時(shí)間后，本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。例如，Ames試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照未出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)考慮突變菌株可能發(fā)生問(wèn)題，另一種可能是代謝活化能力不足。所以，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果未呈陽(yáng)性，其實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性亦大大降低。,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,36,三、致突變?cè)囼?yàn)中的一些問(wèn)題 (二)體外試驗(yàn)的活化系統(tǒng) 1哺乳動(dòng)物細(xì)胞介導(dǎo) 使用完整的細(xì)胞，特別是大鼠肝原代細(xì)胞，與測(cè)試細(xì)菌或細(xì)胞一起培養(yǎng)。這也是一種活化系統(tǒng)。它有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各種酶及內(nèi)源性輔助因

15、子，代謝能力優(yōu)于無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)如S9，但不如體內(nèi)活化系統(tǒng)。 2S9 S9指經(jīng)酶誘導(dǎo)劑處理后制備的肝勻漿，再經(jīng)9000g離心分離所得上清液，加上適當(dāng)?shù)木彌_液和輔助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是國(guó)內(nèi)常規(guī)應(yīng)用于體外致突變?cè)囼?yàn)的代謝活化系統(tǒng)，其缺點(diǎn)是S9隨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬或器官不同而有差異；S9含有的大量親核物質(zhì)有可能影響試驗(yàn)的敏感性。 3純化酶和基因工程 應(yīng)用純化細(xì)胞色素P-450、谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶及過(guò)氧化物水解酶，可嚴(yán)格控制代謝產(chǎn)物誘發(fā)突變的條件，但技術(shù)難度大。利用基因工程，將人的細(xì)胞色素P-450基因，插入組合細(xì)胞內(nèi)，用上述細(xì)胞進(jìn)行致突變?cè)囼?yàn)，使細(xì)胞具有代謝活化系統(tǒng)。,觀察化學(xué)毒物致突變作用

16、的基本方法,37,三、致突變?cè)囼?yàn)中的一些問(wèn)題 (三)致突變?cè)囼?yàn)與致癌試驗(yàn)的關(guān)系 已知大多數(shù)化學(xué)致癌物具有致突變作用，遺傳學(xué)改變?cè)谠┗蚣せ詈鸵职┗蚴Щ钌掀鹬饕饔?，致癌物誘致關(guān)鍵靶基因遺傳改變的直接作用等在哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。 發(fā)現(xiàn)人類接觸致癌物與DNA加合物，同其腫瘤中癌基因和抑癌基因的特異堿基對(duì)突變之間具有相關(guān)性。 傳統(tǒng)的長(zhǎng)期致癌試驗(yàn)，花費(fèi)大，周期長(zhǎng)，不能適應(yīng)化學(xué)物質(zhì)快速增長(zhǎng)的需要。此外，致癌試驗(yàn)所用動(dòng)物數(shù)量有限，難以檢出弱的致癌物。需要發(fā)展多種體內(nèi)和體外短期試驗(yàn)，用于對(duì)化學(xué)物質(zhì)致癌性進(jìn)行篩檢。,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,38,三、致突變?cè)囼?yàn)中的一些問(wèn)題 (四)試驗(yàn)結(jié)果在毒理學(xué)

17、安全性評(píng)價(jià)中的作用 陰性結(jié)果判定條件： 最高劑量應(yīng)包括受試物溶解度許可或灌胃量許可的最大劑量。如該劑量毒性很大，則體內(nèi)試驗(yàn)和細(xì)菌試驗(yàn)應(yīng)為最大耐受量。使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)，常選LD50或LD80為最大劑量。溶解度大、毒性低的化學(xué)物，在細(xì)菌試驗(yàn)中可以5000g皿作為最高劑量。 各劑量組的組間差距不應(yīng)過(guò)大，以防漏檢僅在非常狹窄范圍內(nèi)才有突變能力的某些化學(xué)毒物。滿足上述條件，仍為陰性，才慎重下結(jié)論。,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,39,三、致突變?cè)囼?yàn)中的一些問(wèn)題 (四)試驗(yàn)結(jié)果在毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)中的作用 陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)具有劑量反應(yīng)關(guān)系，即隨劑量增加，致突變作用增加；和在一組或多組的觀察值與陰性

18、對(duì)照比較有顯著性差異。陽(yáng)性結(jié)論，即表明受試物具有致突變性，而不同致突變?cè)囼?yàn)的遺傳學(xué)終點(diǎn)不同，其所表示的含義不一。如基因突變是具有導(dǎo)致遺傳性疾病的突變，DNA修復(fù)的實(shí)際后果尚不明確。,觀察化學(xué)毒物致突變作用的基本方法,40,致突變?cè)囼?yàn)舉例,美國(guó)EPA毒物處(1936)提出了一個(gè)三階段的試驗(yàn)方案，把遺傳毒性檢測(cè)和生殖細(xì)胞致突變性驗(yàn)證分階段進(jìn)行。 第一階段測(cè)試化學(xué)物的遺傳毒性，包括Ames試驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)、體內(nèi)骨髓染色體損傷試驗(yàn)(微核試驗(yàn)或染色體畸變?cè)囼?yàn))； 第二階段測(cè)試對(duì)生殖細(xì)胞的致突變作用； 第三階段為哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞致突變性標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)。 在遺傳危害性評(píng)價(jià)時(shí)，在體外基因突變?cè)囼?yàn)中

19、呈陽(yáng)性的化學(xué)物應(yīng)進(jìn)行與哺乳類性腺DNA相互作用的試驗(yàn)，包括睪丸細(xì)胞的SCE、UDS、染色體畸變及堿性洗脫試驗(yàn)等，也可進(jìn)行顯性致死試驗(yàn)，在第二階段中出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，需進(jìn)行小鼠特異座位試驗(yàn)，可觀察形態(tài)改變或生化改變；在體內(nèi)骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或微核試驗(yàn)中呈陽(yáng)性的化學(xué)物需進(jìn)行顯性致死試驗(yàn)，在第二階段中出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，再進(jìn)行小鼠可遺傳易位試驗(yàn)。,41,致突變?cè)囼?yàn)舉例,國(guó)際協(xié)調(diào)組織(1CH)(1997)對(duì)于藥品的遺傳毒性評(píng)價(jià)建議的檢測(cè)試驗(yàn)組合為 細(xì)菌基因突變?cè)囼?yàn)； 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞比試驗(yàn)； 體內(nèi)嚙齒類造血細(xì)胞染色體損傷試驗(yàn)(骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或骨髓或外周血多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn))。 在對(duì)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合得到的致突變作用結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步研究時(shí)，其他試驗(yàn)如DNA加合物測(cè)定、DNA鏈斷裂檢測(cè)、DNA修復(fù)和