1、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,1,PPT學(xué)習(xí)交流,通過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測定，學(xué)習(xí)用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理及操作。,一、實驗?zāi)康?2,PPT學(xué)習(xí)交流,質(zhì)粒(Plasmid) ： 質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。 在細胞內(nèi)它們常以共價閉環(huán)的超螺旋形式存在。存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。,二、實驗原理,3,PPT學(xué)習(xí)交流,4,PPT學(xué)習(xí)交流,質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，具有以下特點： 易于鑒定； 在受體細胞中可以獨立

2、復(fù)制； 易于篩選； 易于導(dǎo)入受體細胞。,5,PPT學(xué)習(xí)交流,二、實驗原理,6,PPT學(xué)習(xí)交流,SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細菌細胞后，會導(dǎo)致細菌細胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細胞中同時釋放出來。釋放出來的DNA遇到強堿性(NaOH)環(huán)境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細菌中提取出來。,7,PPT學(xué)習(xí)交流,三、主要試劑及作用

3、,溶液：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成 (保護、緩沖) 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的 機械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒 (保護作用) EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子, 防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用（保護作用） Tris-HCl 使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）,8,8,PPT學(xué)習(xí)交流,溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與 NaOH 組成(裂解、變性) SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性（裂解細胞和蛋白質(zhì)變性作用） NaOH（PH12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）,9,9,PPT學(xué)習(xí)交流,溶液III：HA

4、c和 KAc組成的高鹽溶液 (復(fù)性，分離) HAc溶液能中和溶液的堿性，使染色體DNA 變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。 KAc會與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的DNA也會與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。,10,PPT學(xué)習(xí)交流,四、試劑配制 溶液：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。 1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min ，貯存于4。 溶液：0.2N

5、NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。 3. 溶液：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存?zhèn)溆谩?11,PPT學(xué)習(xí)交流,4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存?zhèn)溆谩?5. 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1） 6. 乙醇（無水乙

6、醇、70%乙醇） 7. 5TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na22H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存?zhèn)溆谩?8. RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20。,12,PPT學(xué)習(xí)交流,實驗步驟,加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12000g30S 除去上清，加入冰的200 l 溶液I，劇烈振蕩EP管，室溫3min 加入300l 溶液II，快速顛倒數(shù)次，冰浴3min 加入400l 冰溶液III，溫和振蕩10s，冰浴5min，12000g5min 轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積酚/氯仿(1:1)，溫和振蕩，冰浴3min，12000g5min 上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管，加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻，