1、質(zhì)粒改造,趙雨佳 張楠楠,實(shí)驗(yàn)流程:,DNA重組技術(shù),質(zhì)粒改造歷程,閱讀質(zhì)粒圖譜,實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及注意事項(xiàng),領(lǐng)域最新進(jìn)展或現(xiàn)實(shí)意義,天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。 第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101, colE1,pBR313和pBR322。 第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。 第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體

2、，表達(dá)型載體及各種探針型載體。,發(fā)展概況,質(zhì)粒改造歷程,1）pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。 2）由pSF2124、pMB8及pSC101三個(gè)親本質(zhì)粒經(jīng)復(fù)雜的重組過(guò)程構(gòu)建而成的。 3）把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達(dá)組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成。,pBR322,重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體,4）過(guò)百個(gè)限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，一種限制性內(nèi)切酶只有單一切口的位點(diǎn)也多達(dá)數(shù)十個(gè)，幾乎具備了所有常用限制酶都能切開(kāi)并插入目的基因的優(yōu)越條件。 此外，pBR322DNA，被限

3、制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小均已知道，可以作為核酸電泳的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。,松弛型復(fù)制,pBR322：,氯霉素可擴(kuò)增,拷貝數(shù) 50 - 100 / cell,用于基因克隆,pUC質(zhì)粒系列,pUC質(zhì)粒系列也是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的。 它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ 基因及其啟動(dòng)子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker.,三個(gè)顯著特點(diǎn)： （1）分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞含500-700個(gè)拷貝）。 （2）含易于檢測(cè)是否有外源

4、DNA插入的標(biāo)記基因LacZ，可利用-互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。 （3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。 其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到M13mp載體，進(jìn)行DNA測(cè)序和體外突變等研究。,476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表達(dá)半乳糖苷酶的片段。 LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動(dòng)子Plac和操縱基因O。 lacZ之內(nèi)是M13的多功能連接器。,第一步：了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。選用哪種載體要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。 第二步：再看篩選標(biāo)

5、記，如抗性. Ampr：水解p一內(nèi)酰胺環(huán)，具氨芐抗性。 tetr：阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 camr：生成氯霉素羥乙?；苌铮怪ザ拘?。 neor(kanr)：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。 hygr ：使潮霉素B失活。,閱讀質(zhì)粒圖譜,第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般來(lái)說(shuō)，外源 DNA 片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)

6、定，轉(zhuǎn)化效率越低。,合格質(zhì)粒的組成要素,1、復(fù)制起始位點(diǎn)Ori 即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。 2、抗生素抗性基因 可以便于加以檢測(cè)，如Amp+ ,Kan+ 3、多克隆位點(diǎn)MCS 克隆攜帶外源基因片段 4、P/E 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子 5、Terms 終止信號(hào) 6、加poly(A)信號(hào) 可以起到穩(wěn)定mRNA作用,載體選擇,1、構(gòu)建DNA重組體的目的，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。 2、載體的類型： （1）克隆載體的克隆能力。 （2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型原核/真核/穿梭。 （3）對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意 3 點(diǎn)： 選擇合適的啟動(dòng)子

7、及相應(yīng)的受體菌； 用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)注意閱讀框錯(cuò)位； 表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。 3、載體 MCS 中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。,克隆載體的必要性,基因工程中有克隆載體和表達(dá)載體，克隆載體可以在受體菌中大量復(fù)制，表達(dá)載體用于表達(dá)目的蛋白，那么實(shí)際應(yīng)用中，我們的最終目的是要得到目的蛋白，克隆載體不能完成表達(dá)，有何用呢？ 表達(dá)載體是否有何缺陷不能整合克隆載體的功能？ 構(gòu)建兼有克隆和表達(dá)雙重功能的載體有何困難？ pcr產(chǎn)物直接酶切連接？,數(shù)量 1.克隆的目可用于各種文庫(kù)的建立，比如人類基因組計(jì)劃。 2.克隆載體沒(méi)有表達(dá)所需

8、的各種片段，所以可以容納更長(zhǎng)的目的片段，即可以克隆足夠長(zhǎng)的基因，效率更高。 3.克隆載體可以使目的基因在宿主中低成本便捷的擴(kuò)增 4.表達(dá)載體的目的多樣化的用表達(dá)載體克隆基因不是不可以，實(shí)際工作中要考慮更多，因此更復(fù)雜。 質(zhì)量 1.克隆載體便于穩(wěn)定保存目的基因 2.克隆載體上有很多合適的酶切位點(diǎn)供選用 3.克隆載體提供驗(yàn)證，如測(cè)序的方法,一般的策略：將目的片段克隆于非常簡(jiǎn)單的克隆載體上，按照需要再亞克隆于可以滿足各種要求的表達(dá)載體上。回答的不是很系統(tǒng)，如有問(wèn)題可以繼續(xù)來(lái)信討論，希望對(duì)你有所幫助。 T/A 克隆載體可以直接克隆 PCR 產(chǎn)物，省去了兩端加裝識(shí)別位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，可直接連接克隆載體。 已知

9、序列直接PCR產(chǎn)物連接表達(dá)載體是很少幾率出錯(cuò)的，這樣做實(shí)際上是為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)。,PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析,實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及注意事項(xiàng),酶切問(wèn)題分析,連接注意事項(xiàng),結(jié)果鑒定,無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物,非特異性擴(kuò)增,拖尾,假陽(yáng)性,PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析,無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer對(duì)樣品不合適 引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解 反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短,原因,對(duì) 策,純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量 更換Buffer或調(diào)整濃度 重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物 降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間,現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)；,非特異性擴(kuò)增,現(xiàn)象：PCR

10、擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。,引物特異性差 模板或引物濃度過(guò)高 酶量過(guò)多 Mg2+濃度偏高 退火溫度偏低 循環(huán)次數(shù)過(guò)多,原因,對(duì) 策,重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR 適當(dāng)降低模板或引物濃度 適當(dāng)減少酶量 降低鎂離子濃度 適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 減少循環(huán)次數(shù),拖尾,現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear（彌散）狀態(tài)。,M 1 2,模板不純 Buffer不合適 退火溫度偏低 酶量過(guò)多 dNTP、Mg2+濃度偏高 循環(huán)次數(shù)過(guò)多,原因,對(duì) 策,純化模板 更換Buffer 適當(dāng)提高退火溫度 適量用酶 適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度 減少循環(huán)

11、次數(shù),假陽(yáng)性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況),原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染,現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物,對(duì)策： 操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外； 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。 各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。,PCR產(chǎn)物純化,PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？ 如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。,確定DNA濃度： 1）marker說(shuō)明上是否有標(biāo)明條帶的DNA濃度，如果有，那么根據(jù)電泳的條帶亮度與marker亮度對(duì)比去估計(jì)DNA濃度 2）用分光光度計(jì)去測(cè)A260nm的OD值。如果測(cè)量OD值的話，你只要得到插入片段和載體的OD值比例關(guān)系就行了，因?yàn)榫唧w計(jì)算的時(shí)候考慮的也只是比例而不是實(shí)際濃度。（載體片段和插入片段進(jìn)行電泳的時(shí)候，能夠看到清晰的條帶。）,酶切問(wèn)題分析,連接重要的注意事項(xiàng)： 1.載體總量 2.載體