1、雙節(jié)液相色譜法，高效液相色譜法是以液體為流動相的新型快速色譜分離技術(shù)。近年來，隨著牙齒技術(shù)的快速發(fā)展，高效液相色譜分析逐漸進入了“成熟”階段，高效液相色譜在生命科學(xué)、能源科學(xué)、環(huán)境保護、有機和無機新材料等前沿科學(xué)領(lǐng)域和傳統(tǒng)成分分析中的應(yīng)用占有重要地位。高效液相色譜的儀器和設(shè)備也越來越完善和現(xiàn)代化，預(yù)計在不遠的將來，高效液相色譜儀將成為與氣相色譜儀一起使用最常用的分析器儀器。1.液相色譜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、原理和流程高效液相色譜系統(tǒng)的基本組成部分包括溶劑輸送系統(tǒng)、樣品系統(tǒng)、顏色頻譜分離系統(tǒng)、檢查記錄和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)四個部分。如圖429所示，圖429中的高效液相色譜流程圖在槽中的溶劑脫氣和過濾后，使用高壓泵

2、以一定的流量輸送到頻譜柱的入口(如果使用梯度洗滌，則應(yīng)使用雙泵系統(tǒng)輸送溶劑，流動上各溶劑的比例由梯度裝置控制)。)，將樣品注入樣品裝置，運至洗脫液(流化床)，在頻譜柱內(nèi)分離，分離的組從頻譜柱流出探測器產(chǎn)生的傳記信號由記錄計記錄或通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)處理，這是定性和定量的。(威廉莎士比亞，溫斯頓，離別，離別，分離，分離，分離，分離)廢液罐收集所有流出的液體。高效液相色譜的基本組成部分已經(jīng)如上，其中最重要的工作單位是高壓泵、頻譜柱、探測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。一液相色譜系統(tǒng)(1)高壓泵高壓泵是高效液相色譜系統(tǒng)中最重要的部件之一。在氣相色譜中，利用高壓鋼瓶提供一定壓力和流速的裝載機。在高效液相色譜法中

3、，利用高壓泵獲得一定壓力和流速的負荷額。在高效液相色譜法中，色譜柱細(17毫米)，固定相顆粒小(粒度只有幾十微米)，因此色譜柱對流動相的阻力很大。為了使洗脫液更快地通過頻譜柱，快速有效地分離，必須用高壓泵提供高柱前壓力，以便輸送洗脫液。高壓泵一般應(yīng)滿足以下要求：a .高壓交付通常為1 . 471043 . 43104 kpa(150350千克/cm2)。b .壓力穩(wěn)定，沒有脈沖波動. c .流速穩(wěn)定，有可曹征的范圍。d .可連續(xù)注射，適用于拔模洗脫工作。e .密封性能好，紗空間小，清洗容易，耐溶劑腐蝕。高壓泵的種類很多，分類方法也不同。通常根據(jù)輸送溶液的性質(zhì)，可分為恒流泵和恒壓泵兩類茄子。稱為

4、恒流泵的泵總是能保持輸送液體的流動不變，與外部頻譜柱等阻力無關(guān)。也就是說，溶液的流速與柱壓力無關(guān)。因此，可以滿足高精度分析和梯度清洗的要求。常用恒流泵是往復(fù)活塞泵，是目前高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的恒流泵。往復(fù)式活塞泵的配置類似于一般工業(yè)高壓供應(yīng)泵，如圖430所示，但體積小，主要包括電動機傳動機構(gòu)、液腔、柱塞、單向閥等。馬達驅(qū)動的小柱塞(3毫米左右)在密封環(huán)的小液腔內(nèi)以每分鐘數(shù)十到100次以上的頻率往復(fù)運動。小柱塞拔下后，液體從進口止回閥吸出液體腔。柱塞推進時，入口單向閥在壓力下關(guān)閉，液體從出口單向閥輸出。柱塞再次拔出時，由于管道中液體的外部壓力，出口單向閥關(guān)閉，液體從入口止回閥吸入液體腔。這樣

5、反復(fù)，壓力逐漸上升，輸出液體的流量可以由柱塞的沖程或馬達的旋轉(zhuǎn)速度控制。往復(fù)式活塞泵的優(yōu)點是泵的液腔小(約1/31/2ml)，水流連續(xù)，輸送液體的楊怡不受限制，非常適合漸變洗滌。而且泵的液腔清洗方便，更換溶劑很容易。缺點是，根據(jù)柱塞的往復(fù)運動，有明顯的壓力脈動，因此油類不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生基線噪音?？朔姆椒ㄊ翘砑訅毫嗦菲?，以軟化油類。圖430往復(fù)活塞泵、恒壓泵不同于恒流泵，恒壓泵保持輸出壓力不變，流速不僅取決于泵的輸出壓力，還取決于頻譜柱的長度、固定上的粒度、充電情況、流動上的粘度等。因此，恒壓泵的流速不如恒流泵準(zhǔn)確，適用于流相流速要求不高的情況。這種泵通常具有結(jié)構(gòu)簡單、價格低廉的特點。其中更

6、重要的是氣動放大泵。氣動放大泵是最常用的靜壓泵，以高壓缸為動力源，由氣缸和液體柱組成，結(jié)構(gòu)原理如圖4-31所示。氣缸內(nèi)包含可進行往復(fù)運動的活塞，活塞樞軸連接有液罐活塞，氣缸活塞的面積A1大于液罐面積A2。氣缸壓力為P1，液罐壓力為P2。因為F1=F2。圖431氣動放大泵圖表，氣缸活塞和液筒活塞的面積比約為30:150:1，通常為4533601。用98KPa(1Kg/cm2)壓力的氣體推動活塞時，液缸活塞端面牙齒有4.4103Kpa(45 Kg/cm2)的壓力(無摩擦力)，從而排出液缸內(nèi)的液體，調(diào)節(jié)氣體壓力會改變輸出液體的壓力。工作時，在一定氣壓的作用下，推動氣缸活塞，使液缸中的液體被液缸活塞推

7、走，通過出口單向閥輸出，當(dāng)活塞到達行程末端時，啟動微型開關(guān)，使螺線管閥反向運動氣體切換裝置。反轉(zhuǎn)氣流方向(即氣體進入，出口相互更換)，將驅(qū)動活塞向相反方向移動。此時，出口單向閥因外部高壓油類的反壓力關(guān)閉，洗滌劑通過入口單向閥吸入液缸。液缸裝滿液體后，氣體切換裝置再次反轉(zhuǎn)氣流方向，向前推動活塞，液體從出口單向閥推出，入口單向閥在壓力下關(guān)閉。這樣反復(fù)進行輸液和吸入液。氣動放大泵重新安裝液體的動作很快，通常幾秒鐘就能完成。氣動放大泵的優(yōu)點是，容易獲得高壓，可以輸出無脈流動相，檢測器噪音低，可以通過改變空氣源壓力改變流速，流速調(diào)節(jié)范圍大，泵結(jié)構(gòu)簡單，運行、交換液、清洗方便。缺點是流動相流速與流動相粘度

8、及柱滲透性有關(guān)，流速不穩(wěn)定，持值再現(xiàn)性差，不適合梯度洗脫(除非使用兩臺泵)工作。因此，目前牙齒泵主要適合用菌長法填充色補熱。梯度洗滌劑在高效液相色譜法中，為了進行極性范圍大的混合物的分離，可以采用梯度洗脫工作方法，以改善色譜峰的峰形，提高分離效果，加快分離速度。梯度洗滌是兩種或多種極性不同的溶劑混合構(gòu)成洗脫液，在分離過程中，按照一定的程序，不斷改變洗脫液中溶劑的比例和極性，通過洗脫液中極性的變化提高分離效果，縮短分析時間目的的分離工作方法。(威廉莎士比亞，模板，離別，離別，離別，離別，離別，離別，離別)氣象彩報中的節(jié)目上升和兩首歌有相同之處，前者持續(xù)改變移動上的極性，后者持續(xù)改變溫度，其目的都

9、是改善最高形式，提高分辨率。漸變洗滌可分為外部漸變洗滌和內(nèi)部漸變洗滌兩種茄子方法。a .外部梯度洗滌將溶劑在常壓下通過節(jié)目控制器以一定比例混合，然后由高壓泵輸入頻譜柱的洗脫方式稱為外部梯度清洗。圖4-32示出了相對簡單的外部梯度洗脫裝置。集裝箱A，B包含兩個茄子極性的溶劑，利用兩個容器中液體重力的差異和控制開關(guān)的大小，調(diào)節(jié)B集裝箱中溶劑進入A容器的量，然后繼續(xù)混合進入高壓泵。當(dāng)洗脫液需要混合多個溶劑時，可以徐璐在每個水箱中裝入不同極性的溶劑，通過自動程序切換閥門，以一定的間隔依次連接每個水箱通道。(David aser，Northern Exposure(美國電視電視劇，季節(jié))然后完全混合在可

10、變?nèi)萘康臄嚢铏C里，進入高壓泵。，圖432固定容器，外部梯度洗脫裝置，b .也稱為內(nèi)部梯度洗脫內(nèi)梯度洗脫(高壓梯度洗脫)。溶劑通過高壓泵施加壓力后，進入混合室，在高壓下混合，然后進入頻譜柱的洗脫方式。典型的內(nèi)部梯度洗脫裝置如圖4-33所示。牙齒裝置使用兩個高壓泵，通過調(diào)節(jié)兩個泵的徐璐不同流速，使每個溶劑徐璐不同流速發(fā)生變化，然后充分攪拌，就可以得到徐璐不同極性的洗脫液。牙齒方法的優(yōu)點是，只要程序控制各泵的輸液速度，就能得到任何形式的梯度。缺點是需要兩臺高壓泵，價格比較貴，只能混合使用兩種茄子溶劑。牙齒系統(tǒng)也稱為低壓梯度洗脫系統(tǒng)，因為溶劑在常壓下混合，并通過泵輸送到頻譜柱。為了確保溶劑混合的比例，

11、外部梯度洗脫裝置均使用聽課體積小的往復(fù)式活塞泵或隔膜泵。外部梯度洗滌的優(yōu)點是結(jié)構(gòu)比較簡單，只需要一臺泵。使用自動節(jié)目切換裝置的外部梯度洗脫系統(tǒng)也可以克服自動化水平低、溶劑更換不方便、溶劑量大的缺點。圖4-33內(nèi)梯度洗脫裝置之一，另一梯度洗脫裝置將溶劑A裝入一個容器，直接送入泵，溶劑B裝入另一個容器。必要時，閥C，E可注入螺旋輸液管(見圖434)。閥a、b是高壓液體螺線管閥。漸變開始后，閥門C，D關(guān)閉，閥門E打開，控制回路中螺線管閥門A，B交替打開的時間。溶劑A被高壓泵壓過閥門A或被高壓泵壓過的A溶劑頂出螺旋儲液管的B溶劑。這將按一定的間隔交替進行，兩種溶劑在混合器中充分混合，進入顏色頻譜柱。徐

12、璐其他漸變方法只需控制螺線管閥A，B的開放時間。這種裝置的優(yōu)點是只需要一臺高壓泵，但仍然需要兩個高壓電磁閥門。圖434內(nèi)梯度洗脫裝置2，(2)頻譜柱頻譜分離系統(tǒng)包括頻譜柱、調(diào)溫器、連接管等，其中頻譜柱是高效液相色譜儀的心臟部件。因為如果沒有分離效率高的色譜，性能好的高壓泵、高靈敏度傳感器、梯度洗脫裝置的應(yīng)用都將失去意義。高效液相色譜法中最常用的彩色顯像管由不銹鋼合金材料制成，壓力小于6.9103KPa(70Kg/cm2)，可以使用厚壁玻璃管。好的彩色頻譜柱應(yīng)能承受高壓，管道直徑均勻，尤其是內(nèi)壁要用鏡子拋光。但是，不銹鋼柱管不容易加工，因此，在不銹鋼管內(nèi)壁涂上玻璃或聚乙烯，也有達到這一目的的情況

13、。(威廉莎士比亞、不銹鋼、不銹鋼、不銹鋼、不銹鋼、不銹鋼、不銹鋼)許多彩色頻譜柱的形狀通常為1050厘米，內(nèi)徑為17毫米，因此很容易填充固定床。(3)傳感器是測量移動上各種組件及其含量的傳感器。將用頻譜柱分隔的組件轉(zhuǎn)換為可測量的傳記信號(電流或電壓)，以根據(jù)洗脫液流出的濃度變化自動記錄定性和定量分析。它和頻譜柱是高效液相色譜系統(tǒng)的兩個茄子主要組成部分。對液相色譜檢測器的一般要求是靈敏度高、噪音低、對溫度和流速的變化不敏感、線性范圍大、死體積小、適用范圍廣。到目前為止還沒有理想的高效液相色譜檢測器。探測器仍然是高效液相色譜的薄弱環(huán)節(jié)。探測器一般分為兩類茄子：通用探測器和可選探測器。電子是視差折疊

14、探測器等。后者是紫外線吸收探測器、熒光探測器、傳導(dǎo)器等。目前使用最廣泛的兩種茄子探測器是紫外線吸收探測器和視差折疊探測器。紫外線吸收檢測儀紫外線吸收檢測儀是目前高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的檢測儀。檢測原理是利用樣品中測量的成分，選擇性地吸收特定波長的紫外線。吸光度與成分濃度成正比，流動相在使用的波長范圍內(nèi)不被吸收，因此可以定量檢測要測量的成分。雙光路結(jié)構(gòu)的紫外線吸收探測器的光路圖如圖435所示。h低壓汞燈；L1、L2、L3、L4、L5鏡頭；w明暗處理C1示例池；C2基準(zhǔn)池；F1、F2過濾器；p棱鏡E1，E2光電池。圖435紫外線吸收探測器光道，光源通常使用低壓汞燈。低壓汞燈H發(fā)出的光通過透鏡L1

15、聚焦平行光，通過遮光板W分成小平行光，通過透鏡L2、L3分別到達樣品池C1和基準(zhǔn)池C2。樣品從頻譜柱分離，流入樣品池時，由于樣品的紫外線吸收，樣品光程和基準(zhǔn)光程之間的亮度有差異。(David aser，Northern Exposure(美國電視電視劇)，樣品)強度不同的兩種光，分別通過濾波器F1，F(xiàn)2去除不必要的其他波長的非相干光，然后照射兩對光電池，轉(zhuǎn)換為傳記信號，這樣就可以放大差異，然后檢測到。為了減少色譜峰的擴展，檢測池的體積必須小。目前標(biāo)準(zhǔn)紫外線吸收檢測儀的檢測池長10毫米，直徑1毫米，池體積8l。其結(jié)構(gòu)通常為H型或Z型，如圖436所示，但采用H型結(jié)構(gòu)更合理。根據(jù)能否調(diào)節(jié)使用的波長，

16、紫外線吸收探測器可以分為固定波長和可曹征波長兩種。H型Z型圖436示例池結(jié)構(gòu)圖表，固定波長紫外線吸收探測器：牙齒檢測器使用固定波長，測量波長通常為254nm和280nm，大多數(shù)裝置只能在牙齒兩個波長中運行。最常用的是254nm。牙齒探測器通常使用低壓汞燈作為光源。低壓汞燈的紫外線區(qū)域光譜簡單，因此254nm的頻譜強度最高?？刹苷鞑ㄩL紫外吸收探測器：牙齒探測器和固定波長紫外吸收探測器的主要區(qū)別在于使用連續(xù)光源和光柵(或濾波器)，如氘燈。這通常相當(dāng)于波長范圍為210800nm的紫外線可見分光光度計。更高級的儀器在色譜分析過程中，可以隨時暫停移動相，對感興趣的色譜峰上的相應(yīng)分量進行波長掃描，以獲得牙

17、齒峰分量的紫外可見吸收光譜，從而獲得最大吸收波長數(shù)據(jù)。牙齒方法稱為“靜止掃描”。紫外線吸收檢測儀的優(yōu)點是靈敏度高，最低檢測濃度達到10-9g/ml，因此還能檢測紫外線吸收弱的物質(zhì)。此外，牙齒檢測器結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，對溫度和流速的變化不敏感，是梯度洗滌的理想檢測器。缺點是只能用于紫外線有吸收成分的檢查，不能用于測量波長不吸收紫外線樣品的測量。此外，不能使用被測量波長的紫外線吸收的溶劑(如苯等)，從而限制溶劑的選擇。單波長或可變波長紫外線吸收探測器幾乎是高效液相色譜的必需探測器。差分折射檢測器差分折射檢測器基于對包含正在測試組件的流的折射率變化的測量，相對于純流階段。理想情況下，溶液的折射率為純

18、溶劑(流動相)和純?nèi)苜|(zhì)(成分)的折射率，以及每種物質(zhì)的物質(zhì)濃度，即N溶液=c1n1 c2n2式的C1，C2是溶劑和溶質(zhì)的濃度，n1，n2是溶劑和溶質(zhì)的折射率。常識表明，如果溫度恒定，溶液的濃度與包含要測量的成分的流動相和純流動上的折射率差成正比。因此，只要溶劑和樣品的折射率存在一定的差異，就可以檢測到。視差折疊探測器可以根據(jù)工作原理分為兩種茄子類型。一個原理是，通過兩種不同折射率的液體填充的傳感池的光線是與折射率差異成比例的偏轉(zhuǎn)角度。另一個是反射式。牙齒探測器的檢測基礎(chǔ)是菲涅爾反射定律。一般來說，高效液相色譜法比較使用后者。因此，下面僅說明反射差動折射探測器。，反射式視差折射探測器是根據(jù)菲涅爾反射定律測量的，其內(nèi)容是兩個徐璐不同介質(zhì)的界面反射光的百分比與入射角和兩個介質(zhì)的折射率成正比。(阿爾伯特愛因斯坦，美國電視電視劇，反射鏡)入射角固定時，光線反射百分比僅與兩種介質(zhì)的折射率有關(guān)。當(dāng)以恒定強度的光線通過基準(zhǔn)池(僅通過流動)時，由于流動配置是恒定