1、第五章 基因治療Gene Therapy,一、概念,經(jīng)典的基因治療：指正常的基因整合入細胞基因組以校正或置換致病基因的一種治療方法。 廣義的基因治療：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達到治療疾病目的的方法。,1.基因治療分類,體細胞(somatic cell)基因治療 生殖細胞(germline)基因治療,只限于某一體細胞的基因的改變 只限于某個體的當代 對缺陷的生殖細胞進行矯正 當代及子代,1990年9月14日：第一例正式批準的基因治療實驗開始進行 （美國，世界上開展基因治療最早的國家） 大規(guī)模進行基因治療臨床實驗必須經(jīng)歷以下階段： 體外試驗和動物試驗 I期臨床試驗6-

2、10名志愿者 II期臨床試驗20-30名志愿者 III期臨床試驗充分分析療效、安全性 中國：1991年7月開始進行基因治療試驗,2.基因治療發(fā)展簡史,世界上第一個正式被批準用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。 1990年9月美國Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗。,腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID),病因: 淋巴細胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆積 破壞免疫功能 患兒很少活到成年,第一個基因臨床治療的方案(1990.9.14,NIH),治療策略： 淋巴細胞ADA酶 恢復至正常水平的 5%-

3、10% 維持免疫系統(tǒng)功能 改善病人癥狀,治療基本步驟:,ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 導入患者淋巴細胞 體外擴增 回輸病人體內(nèi) 淋巴細胞ADA酶恢復至正常水平的5%-10% 維持免疫系統(tǒng)功能,改善病人癥狀,一、基因治療的策略,The Strategy of Gene Therapy,（一）基因置換（gene replacement）,定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟毎ㄟ^定位重組，以導入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。,目的：將缺陷基因的異常序列進行矯正。 對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復，不涉及基因組的任何改變。,又稱為基因打靶(gene targeting） 定點整合的條件:

4、轉(zhuǎn)導基因的載體與染色體上的DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實現(xiàn)。,基因同源重組技術(shù),要實現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組技術(shù)使相應的正?；蚨ㄏ?qū)胧荏w細胞的基因缺陷部位。,定向?qū)氲陌l(fā)生率約1/100萬，采用胚胎干細胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達1/10。,基因置換必要條件：,1、對導入的基因及其產(chǎn)物有詳盡的了解 2、外來基因能有效地導入靶細胞 3、導入基因能在靶細胞中長期穩(wěn)定存在 4、導入基因能有適度水平的表達 5、基因?qū)氲姆椒八幂d體對宿主細胞安全無害,（二） 基因添加,基因添加或稱基因增補（g

5、ene augmentation）: 通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。,類型: 在有缺陷基因的細胞中導入相應的正?；?，而細胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導入正?；虻谋磉_產(chǎn)物，補償缺陷基因的功能； 向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產(chǎn)物達到治療疾病的目的。,基因干預(gene interference) 指采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因而使之不表達，以達到治療疾病的目的。,反義核酸： 封閉基因表達 核酶： 裂解特異的靶mRNA RNA干涉技術(shù)：,（三）基因干預,（四）自殺基因治療 自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。 原理:將“自

6、殺”基因?qū)胨拗骷毎?，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產(chǎn)生“自殺”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。,自殺基因的作用機制,1.自殺基因系統(tǒng),TK/GCV 單純皰疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因編碼胸苷激酶， 胸苷激酶特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir, GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷， 后者能抑制DNA聚合酶活性，導致細胞死亡。,CD/5-FC 大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase, CD）基因， 胞嘧啶脫氨酶在細胞內(nèi)將無毒

7、性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5-氟尿嘧啶（5-FU）。 5-氟尿嘧啶通過競爭性抑制胸苷酸合酶的活性，從而抑制脫氧胸苷三磷酸的合成。,旁觀者效應:“自殺基因”治療不僅使轉(zhuǎn)導了“自殺基因”的腫瘤細胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導“自殺基因”的腫瘤細胞也被殺死。,2. 旁觀者效應,（五）基因免疫治療,通過將抗癌免疫增強細胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應。,二、基因治療的必要條件,發(fā)病機制在DNA水平上已經(jīng)清楚； 要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達產(chǎn)物有詳盡的了解； 該基因正常表達的組織可在體外進行遺傳操作；,外源基因可有效導入靶細胞 外源基因能在靶細胞

8、中長期穩(wěn)定存留 導入基因能適量表達 導入基因的方法及載體對宿主細胞安全無害,理想的基因治療還必須：,二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù),The Technique of Gene Transfer,基因治療途徑,1、間接體內(nèi)治療途徑（ex vivo) 是先從患者體內(nèi)取出某一器官組織的細胞，體外擴增后，將目的基因轉(zhuǎn)入靶細胞形成表達外源基因的遺傳修飾細胞，選擇高表達的細胞擴增培養(yǎng)，以一定數(shù)量移植患者體內(nèi)。（安全、易控制但操作復雜） 2、直接體內(nèi)治療途徑（in vivo） 將目的基因體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移到靶細胞，所用載體必須具有特異的導向性和轉(zhuǎn)移效率。（操作簡單但療效短、免疫排斥等）,基因治療的兩種途徑,載體,目的基因,in

9、 vivo,ex vivo,靶細胞,基因轉(zhuǎn)移(gene transfer)技術(shù)：,1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。 2.非病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。,1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。,具有包膜，圓球狀，直徑為80120nm 基因組是單正鏈RNA，3.59.0kb 病毒顆粒中有逆轉(zhuǎn)錄酶 能整合于宿主細胞的染色體,（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retroviruses）,逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒結(jié)構(gòu),Reverse transcription Integration Tra

10、nscription Packaging,Lifecycle of retrovirus,逆轉(zhuǎn)錄病毒整合入宿主DNA中的分子機制，其本質(zhì)是轉(zhuǎn)座,LTR(long-terminal repeat):長末端重復序列,Provirus(原病毒): 被整合到細胞基因組中的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列,Two fates of RNA:,Translation:作為mRNA翻譯成病毒的蛋白質(zhì) Packaging：作為病毒RNA基因組被裝配成新的病毒顆粒,Everything is ready!,Packaging,2 RNAs in 1 virus,HIV 從受感染細胞的質(zhì)膜出芽的情形,逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生包括將RNA包

11、裝到衣殼中，然后從細胞的細胞膜上得到部分膜，出芽釋放。,Genome Structure of Retrovirus,（1）兩端各有一長末端重復序列LTR。,（2）LTR由U3、R和U5三部分組成。,(1)在U3內(nèi)有增強子和啟動子； (2)U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS) ； (3)在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號。,逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點,（3）病毒有三個結(jié)構(gòu)基因,(1)gag基因，編碼核心蛋白； (2)pol基因，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶； (3)env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。,（4）5端LTR下游有一段病毒包裝所必需的包裝信號序列（）及剪接供體

12、位點(SD)和剪接受體位點(SA)。,逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點,構(gòu)成逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由兩部分組成：,(1)保留病毒顆粒的包裝信號而缺失病毒蛋白基因,(2) 輔助細胞株(如PA317)：它由缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒感染構(gòu)建而成,Retroviral packaging system,LTR,gag,pol,env,LTR,Gag蛋白,PoL蛋白,Env蛋白,包裝細胞系,LTR,LTR,靶細胞,目的基因,標記基因,LTR,LTR,目的基因,標記基因,1,2,3,4,5,假病毒顆粒的產(chǎn)生并感染靶細胞,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,重組逆轉(zhuǎn)錄病毒 (核酸部分只能是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體),輔病毒,逆轉(zhuǎn)錄

13、病毒載體的特點,逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進入靶細胞。,逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。,前病毒可以高效整合至靶細胞基因組中，有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。,包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點,隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7 kb以下的外源基因。,（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體,腺病毒是一種大分

14、子(36 kb)雙鏈無包膜DNA病毒。 它通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)， 腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。 腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細胞，如神經(jīng)元等。,纖毛,腺病毒的優(yōu)點,1.基因?qū)胄矢?，對人類安全?2.宿主范圍廣；,3.基因轉(zhuǎn)導與細胞分裂無關(guān)；,4.重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；,5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5 kb外源基因；,腺病毒載體缺點,2.宿主的免疫反應導致腺病毒載體表達短暫。,3.有兩個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復制型腺病毒。,4.靶

15、向性差。,1.不能整合到靶細胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細胞，導入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機會增多，表達時間相對較短。,(1)腺病毒產(chǎn)生過程中與293輔助細胞內(nèi)E1區(qū)序列發(fā)生同源重組； (2)腺病毒載體與被治療的患者體內(nèi)已感染的野生型腺病毒，甚至乳頭瘤病毒、巨細胞病毒發(fā)生重組。,（3）腺病毒相關(guān)病毒載體,腺病毒相關(guān)病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。 其基因組DNA小于5 kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。 AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進行復制和溶細胞性感染，

16、否則只能建立溶源性潛伏感染。,Structure of AAV Virus Genomic DNA,REP:病毒復制基因, CAP:編碼衣殼蛋白的基因,AAV的特點, 以潛伏感染為主； 病毒基因組與細胞共存； 只要宿主細胞正常，AAV基因表達就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)； 若細胞受刺激，表達應激基因，AAV基因表達從而使AAV病毒復制； 產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細胞，建立新的潛伏狀態(tài)。,AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對人類無致病性。 AAV可以高效定點整合至人19號染色體的特定區(qū)域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。 這種靶向定點整合可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原

17、癌基因激活的潛在危險性， 而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達，并可受到周圍基因的調(diào)控，兼具逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點。,AAV載體的缺陷：,2.非病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),（1）脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。 基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，并進行表達。,脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移示意圖,脂質(zhì)體介導法缺點： 脂質(zhì)體介導進入靶細胞內(nèi)，易被單核-吞噬細胞系統(tǒng)選擇性吞噬、降解。,缺點：受體介導的DNA通常進入細胞溶酶體內(nèi)被降解。,（

18、2）受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù),將DNA與細胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。 這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。 多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負電荷的DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。 這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞。,受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖,（3）基因直接注射技術(shù),不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。 動物實驗表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應的蛋白質(zhì)，并能維持數(shù)月之久。 1.將促進心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其

19、心臟壁內(nèi)毛細血管增加30%40%； 2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； 3.肌內(nèi)注射凝血因子基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等。,基因直接注射法的優(yōu)點,1.制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易； 2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用； 3.導入的基因不需整合即可表達，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點； 4.基因直接注射法可反復使用，而病毒載體則可能誘導體內(nèi)免疫應答，致使反復治療效果下降。,三、基因轉(zhuǎn)移的靶細胞,靶細胞的選擇須考慮： 容易取出和移植。血液系統(tǒng)的細胞、成纖維細胞、成肌細胞； 細胞具有較長的壽命 離

20、體細胞較易受外源基因轉(zhuǎn)化 離體細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染和一定時間培養(yǎng)后再植回體內(nèi)，仍較易成活,體細胞,生殖細胞,目前常用的靶細胞有： 造血細胞 皮膚成纖維細胞 肝細胞 血管內(nèi)皮細胞 淋巴細胞 肌肉細胞 腫瘤細胞,三、基因干預,Gene Interference,主要干擾特定細胞的mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯,基因干預的種類：,1.反義RNA (antisense RNA) 2.干擾RNA (RNA interference) 3.核酶 (ribozyme),（一）反義RNA,Definition: 反義RNA（Antisense RNA)： 指與靶RNA(或DNA) 具有互補序列的RNA分子。,反義RNA技術(shù),通過體

21、外合成的反義RNA或構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中，利用堿基互補原理結(jié)合細胞中特異mRNA以調(diào)控其表達。,類反義RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶 降解； 類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯； 類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄,1.根據(jù)反義RNA的作用機制分為,反義寡聚核苷酸（類） 與mRNA特異性結(jié)合，阻斷翻譯過程,利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細胞進行基因表達調(diào)控，通常采用的方法有兩種： （1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收RNA后，

22、發(fā)揮作用。 缺點：RNA易降解 （2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用 缺點：細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的反義RNA量不易控制,2. 反義RNA與基因表達調(diào)控,反義RNA的關(guān)鍵技術(shù)問題：,反義RNA進入靶細胞前的降解問題,專一性轉(zhuǎn)移問題：如何解決某一組織、器官或系統(tǒng)中部分細胞病變進行專一性轉(zhuǎn)移治療。,3.受體介導反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù),受受體介導DNA轉(zhuǎn)移方法的啟發(fā)把DNA換成反義RNA，就可以實現(xiàn)受體介導的反義RNA的轉(zhuǎn)移。,將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價連接，得到ASGP-PL復合物，成為運載核酸的工具。 結(jié)合反義RNA，成為ASGPPL反

23、義RNA復合物 ASGP-PL反義RNA復合物可以專一性地被肝細胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細胞中，反義RNA進入肝細胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。,例：,受體介導的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高； 被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護層, 可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。,4.反義RNA的應用（一）,利用反義RNA的原癌基因失活療法： 阻止或抑制原癌基因的過度表達及抑制癌基因突變體mRNA成熟,原癌基因,調(diào)控細胞生長，增殖與分化 正常情況下，表達受嚴格控制 一旦調(diào)節(jié)失控，基因產(chǎn)物（生長因子，生長因子受體，胞內(nèi)外傳遞信號等癌蛋白）分泌過剩，細胞惡性增生，致

24、癌,根據(jù)已知癌基因的核苷酸序列合成反義RNA 相應的反義寡聚核苷酸與腫瘤癌基因活化表達的mRNA的起始翻譯位點結(jié)合成RNA/RNA雙鏈體 雙鏈體阻止核糖體的結(jié)合，或核糖體沿mRNA上移，抑制翻譯,治療方法,抗HIV-l的作用 ：從翻譯水平封閉基因表達，并干擾mRNA的剪切、加工而實現(xiàn)抗病毒作用,反義RNA的應用（二）,tat為HIV-l重要的調(diào)節(jié)基因，編碼反式激活因子 Tat蛋白,它能增強HIV-1基因轉(zhuǎn)錄起始和延伸的效率. TAR序列是TAT激活HIV基因表達所必需的效應元件。處于LTR的R區(qū)內(nèi)。 Tat結(jié)合到TAR的莖環(huán)結(jié)構(gòu)上。,Tat可與RNA結(jié)合因子一起以復合體形式結(jié)合在轉(zhuǎn)錄物的TAR

25、序列上，并與裝配在啟動子處的轉(zhuǎn)錄起始復合體作用， 這種作用導致TFH的激酶活性被激活，結(jié)果RNA聚合酶的羧基端結(jié)構(gòu)域 (CTD)實現(xiàn)磷酸化，使得RNA聚合酶前進，完成HIV轉(zhuǎn)錄單位的閱讀，實現(xiàn)HIV蛋白的大量合成。,抗HIV-l策略,在逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子LTR之后連接反義tat與多聚TAR的構(gòu)建物(LTR-25TAR-AS-TAT) ，具有反義tat及TAR誘餌的雙重作用,gag是HIV-1的結(jié)構(gòu)基因，編碼p24等病毒結(jié)構(gòu)蛋白 Veres等構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在細胞內(nèi)表達互補于gag區(qū)不同長度的反義RNA(225-1225nt) 在CEM-SS T細胞及外周血CD4細胞均有抑制HIV-l復制的

26、作用 長片段反義RNA的抗HIV-l作用更好，可能由于它能與不同種的HIV-l RNA結(jié)合而限制了病毒的逃逸,3. 反義RNA的應用前景,受體介導的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點，而在一定程度上補充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。,（l）安全性高,（2）反義RNA設(shè)計 和制備方便,（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應,（4）能直接作用于一些RNA病毒,反義RNA只作用于特異的mRNA分子，不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)。反義RNA分子無論怎樣修飾，最終將在細胞內(nèi)部被降解，不留“殘渣”。,在治療RNA病毒感染性疾病時，受體介導的反義RNA基因治療比一般的DNA基因治療有更大的優(yōu)勢。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷R

27、NA病毒的繁殖。,1.RNA干擾現(xiàn)象,（二）干擾RNA,對RNA干擾的認識來源于用線蟲（C. elegans）和果蠅所進行的實驗。 實驗結(jié)果顯示，有義鏈RNA（sense RNA）或反義鏈RNA（antisense RNA）均能抑制線蟲基因的表達，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。 將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達。得到的結(jié)果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達途徑。 這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達的效率比反義RNA至少高2個數(shù)量級。,RNA干擾（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。

28、在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。,2.RNA干擾的機制,RNA干擾過程主要有2個步驟：,（1）小干擾性RNA（siRNA）,（2）siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex, RISC)。,該復合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。,長雙鏈RNA被細胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA，siRNA）。,siRNA

29、反義鏈可作為引物。與mRNA結(jié)合，并以其為模板，在依賴于RNA的聚合酶催化下合成新的dsRNA。Dicer切割成siRNA，再識別新的mRNA。這是RNAi的高效性和持久性的原因。,A. 賈第鞭毛蟲Dicer的晶體結(jié)構(gòu)； RNA干擾機制示意圖,1. 體外化學合成;,2. 用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。,siRNA的產(chǎn)生,3.RNA干擾的應用前景 RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學研究、微生物學研究、基因治療和信號轉(zhuǎn)導等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目的進展，使其在醫(yī)學、生物學領(lǐng)域的應用有著廣闊的前景。,（1） 研究基因功能的新工具,由于 RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，

30、可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。,RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，建立多種表型；抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應。,（2） 腫瘤的基因治療,傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長， 而RNA干擾技術(shù)可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計針對這一區(qū)段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產(chǎn)生多個基因同時剔除的表型， 也可以同時使用多種雙鏈RNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時剔除。 RNA干擾技術(shù)可用于治療有異常基因表達的惡性

31、腫瘤。,K-ras蛋白為腫瘤發(fā)生所必需，bcr/ab1融合基因與人白血病有關(guān)， 用RNA干擾技術(shù)可以阻礙K-ras蛋白的表達從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細胞系。 通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達，能促進白血病細胞系的細胞凋亡或增加其對化療藥物的反應性。,（3） 病毒性疾病的基因治療,RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機制。 用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細胞內(nèi)復制。 用RNA干擾技術(shù)抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細胞內(nèi)表達，可阻礙HIV感染細

32、胞。 也可通過RNA干擾抑制其他病毒在細胞內(nèi)復制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。,siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復制，病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，RNA干擾技術(shù)將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。,（三）核酶(ribozyme)用于基因治療,天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由兩個RNA分子組成。,在基因治療時，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當?shù)泥徫唬纬慑N頭核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子達到治療疾?。ㄈ缜宄《净?/p>

33、組RNA）的目的。 只要兩個RNA分子通過互補序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級結(jié)構(gòu)（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應。,錘頭型核酶的二級結(jié)構(gòu) 和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖,三個雙螺旋區(qū) 13個核苷酸殘基保守序列 剪切反應在右上方GUX序列的3端自動發(fā)生,（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）,1. 核酶的設(shè)計,核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設(shè)計核酶。,（1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。,（2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導序列。,在基因治療中，主要是根據(jù)治療的靶基因序列的特點，設(shè)計和合成特