1、實驗五 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用ELISA,一、實驗?zāi)康?了解和掌握免疫酶技術(shù)的測定原理。 掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)的操作步驟，學(xué)會利用競爭ELISA的方法，定量測定抗體或抗原。 了解免疫酶技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要意義及應(yīng)用價值。,二、實驗原理,免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelling technique）: 是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。 特點：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位 分類：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定。,免疫酶技術(shù)(enzyme immunoassa

2、y)： 是將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。 就是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。,酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） 是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。 常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP) 堿性磷酸酶（AP）。,ELISA檢測抗原,Ag + Ab* Ag-Ab*,ELISA檢測抗體,Ab + Ag* Ab-Ag*,ELISA檢測抗體,Ag + Ab1 Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* Ag-

3、Ab1-Ab2*,競爭ELISA檢測抗原,固定OD值,實驗材料： 羊抗人血清白蛋白抗體（一抗） 已知含量的人血清白蛋白（作標(biāo)準(zhǔn)曲線） 待檢人血清白蛋白 辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體（二抗） 包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液 洗板液或稀釋液：PH7.4，0.01mol/L PBS 底物溶液：OPD-H2O2 終止液：2mol/L H2S04 酶標(biāo)反應(yīng)板（一條/人）,三、操作步驟,包被抗原 抗原用包被液（CBS）稀釋至合適濃度，加入到酶標(biāo)板中，100l/孔，放入濕盒中，4過夜。,次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔，1min后傾去），以洗去未包被的游離抗原。,抗原10

4、0ul/孔,濕盒中，4過夜,酶標(biāo)板,抗原與抗體的預(yù)孵育 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 在稀釋板中，用PBS倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗原，每種濃度的抗原最終為50l，分別在各抗原孔中加入250l一定濃度的抗體，放入37恒溫培養(yǎng)箱中30 min。 待測抗原： 取50l未知濃度的抗原按照同上操作。,50ul,稀釋板,3. 與固相抗原的競爭結(jié)合 取稀釋板中預(yù)孵育的抗原抗體混合液100l，加入酶標(biāo)板的抗原孔中，放入37恒溫培養(yǎng)箱中60 min。洗板3次。,100ul,稀釋板,酶標(biāo)板,37，60 min,洗板3次,4. 酶標(biāo)二抗的結(jié)合 酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋至工作濃度后，加入每孔中，100ul/孔，置濕盒中放37 30min。洗板3次。 5. 加入底物顯色液（用前再配制，并置棕色瓶內(nèi)） 每孔加入底物顯色液，100ul/孔，濕盒中37保溫一定時間。 6. 終止反應(yīng) 待出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)（或一定時間）后，加入終止液， 50ul/孔以終止反應(yīng)。 7. 結(jié)果測定 用酶標(biāo)儀在492nm波長下測定OD值。 以標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算未知抗原的濃度。,四、思考題,在定量測定抗原時，直接ELISA與競爭ELISA有何區(qū)別？從理論上分析