1、,第八章原生質(zhì)培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交,主要內(nèi)容,植物原生質(zhì)培養(yǎng)的目的和意義 原生質(zhì)分離 體細(xì)胞雜交 原生質(zhì)體培養(yǎng),一、植物原生質(zhì)培養(yǎng)的目的和意義,1、原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。亞原生質(zhì)體(subprotoplast)：在原生質(zhì)體分離過程中，有時會引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。它可以具有細(xì)胞核或沒有細(xì)胞核。 核質(zhì)體(nuclearplast)：由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體(miniprotoplast)。 胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細(xì)胞核而僅含有部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)

2、,據(jù)統(tǒng)計，目前已有49個科，160個屬的360多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到了再生植株。其趨勢仍以農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物為主，但從一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物擴(kuò)展。,二、原生質(zhì)體分離,1、植物原生質(zhì)體的分離方法,（1）原生質(zhì)體的機(jī)械制備 （2）原生質(zhì)體的酶法分離,（2）Enzymatical preparation of protoplasts,Basic technique:,二、影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的因子,1、材料的來源 2、前處理 3、酶處理 4、滲透壓,1、材料的來源,無菌試管苗葉片、上胚軸和子葉 溫室或生長室栽種的植物 培養(yǎng)細(xì)胞,溫室或生長室栽種的植物,一般生長在下述條件下

3、的植株能產(chǎn)生較好的效果:低光照強(qiáng)度1000lx,短日照,溫度范圍20-25度,相對濕度60%-80%,以及充足的氮肥供應(yīng). 禾本科和其他一些物種的葉肉細(xì)胞難以分離原生質(zhì)體,因此在這些植物中一直利用培養(yǎng)細(xì)胞作為供體材料.,2.前處理,A、材料用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射、材料的預(yù)培養(yǎng)等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同。 龍膽試管苗只有用低溫處理原生質(zhì)體才能分裂； 甘蔗植株只有現(xiàn)在黑暗條件下培養(yǎng)12小時后分離的原生質(zhì)體才能分裂； 馬鈴薯試管苗葉片需在黑暗下處理48小時后分離原生質(zhì)體，才會獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量。,B、消毒 C、保證酶解充分進(jìn)行，促使酶

4、溶液滲入到葉片的細(xì)胞間隙中。 方法： 1.撕去葉片的下表皮，然后以無表皮的一面向下，使葉片漂浮在酶溶液中； 2.把葉片或組織切成小塊，投入到酶溶液中，可與真空滲入相結(jié)合。,3、酶處理,分離植物細(xì)胞原生質(zhì)體所必須的兩種酶是纖維素酶和果膠酶，后者的作用主要是細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解，前者是消化細(xì)胞壁纖維素。 對于某些組織來說,除了纖維素酶和果膠酶外可能還需要半纖維素酶.比如:大麥的糊粉細(xì)胞以纖維素酶處理以后并不能把原生質(zhì)體釋放出來,這是因為在原生質(zhì)體周圍還留下一層抗纖維素酶的壁,這類細(xì)胞稱做原生質(zhì)球,只有用半纖維素酶處理才能把它們剩余的壁除掉.,A、纖維素酶 目前市場上主要有日本生產(chǎn)的分解細(xì)胞壁較好的纖

5、維素酶：Onozuka、Meicelase、Driselase。纖維素酶Onozuka根據(jù)活力高低又分為P1500、P500和R-10等數(shù)種。主要含有纖維素酶C1（作用于天然的和結(jié)晶的纖維素）、纖維素酶Cx，纖維素二糖酶，木聚糖酶、葡聚糖酶果膠酶、脂肪酶、核酸酶、溶菌酶等。,B、半纖維素酶制劑可以降解半纖維素為單糖或單糖衍生物。常用的是Rhozyme Hp150C、果膠酶是從根霉中提取的，使細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解，把細(xì)胞從組織內(nèi)分離出來。常用的果膠酶有MacerozymeR-10（離析酶，主要成分是果膠酶），此酶的活性較高，但含雜酶也較多，如使用濃度過高，時間過長，則有毒害作用。Pectalyas

6、eY-23（離析軟化酶），此酶活性極高，一般葉片使用量為0.1%，懸浮細(xì)胞0.05%,原生質(zhì)體分離常用的商品酶 酶 來 源 生產(chǎn)廠家 纖維素酶類 onozuka R10 綠色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 綠色木霉 Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan 果膠酶類 Macerozyme R-10 根霉 Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan

7、 Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 半纖維素酶 Rhozyme HP-150 黑曲酶 Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Hemicellulase 黑曲霉 Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA,酶解時間,酶濃度,酶解溫度,酶處理效果,酶濃度,植物材料須按比例和酶液混合才能有效地游離原生質(zhì)體，一

8、般去表皮的葉片需酶量較少，而懸浮細(xì)胞則用酶量較大。,酶解時間酶解溫度,酶解處理一般地在黑暗中靜止進(jìn)行，在處理過程中偶爾輕輕搖晃幾下。對于懸浮細(xì)胞，愈傷組織等難游離原生質(zhì)體的材料，可置于搖床上，低速振蕩以促進(jìn)酶解。酶解時間幾小時至幾十小時不等、以原生質(zhì)體游離下來為準(zhǔn)。但是，時間過長對原生質(zhì)體有害，所以一般不應(yīng)超過24h。酶解溫度要從原生質(zhì)體和酶的活性兩方面考慮。對于這幾種酶來說，最佳處理溫度在4050但這個溫度對植物細(xì)胞來說太高，所以一般都在25左右進(jìn)行酶解。,酶溶液的pH值對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和生活力影響很大。用菜豆葉片作培養(yǎng)材料時，發(fā)現(xiàn)原始pH值為50時， 原生質(zhì)體產(chǎn)生得很快，但損壞較嚴(yán)重，并且

9、培養(yǎng)后大量破裂。當(dāng)pH值提高到60時，最初原生質(zhì)體卻產(chǎn)生少，但與pH值為50時處理同樣時間后相比，原生質(zhì)體數(shù)量顯著增加。 高活性低 低原生質(zhì)體損壞多 纖維素酶，p H5.4，果膠酶5.8，兩種混合5.45.6,酶液pH值：4.7-5.8，,4.滲透劑,植物細(xì)胞壁對細(xì)胞有良好的保護(hù)作用。去除細(xì)胞壁之后如果溶液中的滲透壓和細(xì)胞內(nèi)的滲透壓不同，原生質(zhì)體有可能漲破或收縮。因此在酶液、洗液和培養(yǎng)液中滲透壓應(yīng)大致和原生質(zhì)體內(nèi)的相同，或者比細(xì)胞內(nèi)滲透壓略大些。滲透壓大些有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定，但也有可能阻礙原生質(zhì)體的分裂。 因此，在分離原生質(zhì)體的酶溶液內(nèi)，需加入一定量的滲透穩(wěn)定劑，其作用是保持原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定

10、，避免破裂。,常用的兩種系統(tǒng)為,糖溶液系統(tǒng)：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，濃度約在0.400.80mmolL。本系統(tǒng)還可促進(jìn)分離的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁并繼續(xù)分裂； 鹽溶液系統(tǒng)：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。其優(yōu)點是獲得的原生質(zhì)體不受生理狀態(tài)的影響，因而材料不必在嚴(yán)格的控制條件下栽培，不受植株年齡的影響，使某些酶有較大的活性使原生質(zhì)體穩(wěn)定。,另外，添加牛血清蛋白可減少或防止降解壁過程中對細(xì)胞器的破壞。近年來多采用在鹽溶液內(nèi)進(jìn)行原生質(zhì)體分離，然后再用糖溶液作滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。,5、細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑 細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑，能防止質(zhì)膜破壞，提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性與活性，促進(jìn)細(xì)胞壁形成及細(xì)胞

11、分裂等。 常用質(zhì)膜穩(wěn)定劑有：葡萄糖硫酸鉀、MES、CaCl2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid， 2-( N-嗎啉)乙烷磺酸 作用：不但具有質(zhì)膜穩(wěn)定作用，還具有緩沖作用，調(diào)節(jié)pH值。,酶解處理時把滅菌的葉片或子葉等材料下表皮撕掉，將去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在無菌條件下將葉面晾干、順葉脈輕輕撕下表皮。如果去表皮很困難，也可直接將材料切成小細(xì)條，放入酶液中。對于懸浮細(xì)胞等材料，如果細(xì)胞團(tuán)的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龍網(wǎng)篩過濾一次，將原細(xì)胞團(tuán)去掉，留下較均勻的小細(xì)胞團(tuán)時再進(jìn)行酶解。,6、原生質(zhì)體分離（

12、以葉片為例）,A、兩步法分離植物原生質(zhì)體 先用果膠酶離析植物組織，使植物細(xì)胞從組織中分離出來，然后收集細(xì)胞洗滌后用纖維素 酶解離細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體B、一步法分離 把一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對材料進(jìn)行一次性處理。,三、Purification of the isolated protoplasts,酶解后的混合物包括：解離酶液中，有原生質(zhì)體，有破碎細(xì)胞的細(xì)胞器等，也有未解離的組織或細(xì)胞。而培養(yǎng)只要干凈的原生質(zhì)體。所以要進(jìn)行純化。 凈化的方法： A、清除較大碎屑：酶解后的混合物穿過一個鎳絲網(wǎng)（50-70um）,B、清除較小的物質(zhì)：,1.沉降法 2.漂浮法 3.界面法,1.沉降法,鎳絲

13、網(wǎng)濾出液 置于離心管（離心2-3分鐘，原生質(zhì)體沉于離心管底部，殘液碎屑懸浮于上清液） 棄去上清液 再把沉淀物重新懸浮于清洗培養(yǎng)基中（反復(fù)3次） 常用的清洗培養(yǎng)基CPW鹽溶液成分（mg/l）,轉(zhuǎn)速的控制以將原生質(zhì)體沉淀而細(xì)胞碎片等雜質(zhì)仍懸浮在上清液中為準(zhǔn)，一般于500800r/m的轉(zhuǎn)速下離心35min。用吸管小心的吸掉上清液，用洗滌液洗滌三次，然后用培養(yǎng)基將原生質(zhì)體調(diào)整到一定密度后進(jìn)行培養(yǎng)。,2.漂浮法,根據(jù)原生質(zhì)體來源不同，利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質(zhì)體漂浮其上，殘渣碎屑沉到管底。,3.界面法,原生質(zhì)體純化,以柑桔為例,Purified protoplasts,四、原生質(zhì)

14、體活力測定,目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動性確定原生質(zhì)體活力。如形態(tài)上完整，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色新鮮的原生質(zhì)體即為存活的。,FDA法： 伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使，細(xì)胞才能被染色，因而可以通過細(xì)胞被染色與否確定活性。,影響原生質(zhì)體活力的因素,分離材料的生理狀態(tài) 酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓 分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時間 環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響,第三節(jié) 原生質(zhì)體的培養(yǎng),供體植物的選擇,原生質(zhì)體的培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件,培養(yǎng)方法,細(xì)胞分裂與愈傷組織形成,細(xì)胞壁的形成,植株的再生,影響原生質(zhì)體培

15、養(yǎng)的因素,一、原生質(zhì)體的培養(yǎng)基,1在多數(shù)情況下原生質(zhì)體所用的基本培養(yǎng)基為NT，KM，DPD、MS、B5 2無機(jī)鹽 大量元素濃度；（一般要低于愈傷組織培養(yǎng)基） NO3和NH4+的比例；（降低NH4+ 、NO3 增加有機(jī)氮） Ca2+濃度（增加，適當(dāng)?shù)臐舛?，能提高分裂?xì)胞的百分?jǐn)?shù)） 3有機(jī)成分 維生素、氨基酸、糖（常用葡萄糖，過濾滅菌）及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白 4激素 常用的激素：NAA、IAA、2,4-D（先高后低）與 BA 5pH值,二、培養(yǎng)條件,最初4-7天分離出來的原生質(zhì)體應(yīng)在黑暗中培養(yǎng)（對光很敏感，少做觀察）； 當(dāng)細(xì)胞壁完整形成后，細(xì)胞具有耐光的特性，這時轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)。 溫度一般

16、為27-29 度,三、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法,1.液體淺層培養(yǎng),將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。一般直徑3cm加1-1.5ml培養(yǎng)液，6cm加2-3ml 優(yōu)點：操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。 缺點：是原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步生長與發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個細(xì)胞的發(fā)育情況。,液體淺層培養(yǎng),2.固體平板培養(yǎng)基,也是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點的瓊脂糖可在30度左右融化與原生質(zhì)體融合而不影響原生質(zhì)體的生命活動?；旌虾蟮暮性|(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)點：可以跟蹤觀察單個原生質(zhì)體的發(fā)育

17、情況，易于統(tǒng)計原生質(zhì)體分裂頻率。 缺點：操作要求嚴(yán)格，尤其是混合的溫度掌握必須合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快，原生質(zhì)體不容易混合均勻。,3.液體-固體雙層培養(yǎng),即在培養(yǎng)皿低部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。 優(yōu)點：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。 缺點：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程。,在體細(xì)胞雜交和誘發(fā)突變的研究中，最好能獲得個別細(xì)胞的無性系，因此需要低密度（每毫升培養(yǎng)基100-500個原生質(zhì)體）。,1.培養(yǎng)基

18、 Kao 等配置了一種復(fù)雜的培養(yǎng)基，即KM8p培養(yǎng)基。 2.培養(yǎng)方法,a、飼養(yǎng)層培養(yǎng)X-射線照射原生質(zhì)體，與0.6%瓊脂混合，在培養(yǎng)皿中鋪成平板，作為飼養(yǎng)層，再將生活力正常的原生質(zhì)體與0.6%瓊脂混合，培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上。,b、共培養(yǎng)法,將生長迅速的原生質(zhì)體培養(yǎng)物與難于培養(yǎng)的原生質(zhì)體混合. 前者為后者提供生長因素或成分未知但能促進(jìn)生長的擴(kuò)散型化學(xué)物質(zhì).,五、原生質(zhì)體的發(fā)育與植株再生,細(xì)胞壁再生 細(xì)胞分裂與生長 愈傷組織形成與分化 植株再生,1.細(xì)胞壁再生,原生質(zhì)體將失去它們特有的球形外觀,這種變化被視為再生新壁的象征. 一般原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時后開始再生新的細(xì)胞壁,一至數(shù)天便可形成完整的細(xì)胞壁. 證

19、明細(xì)胞壁再生的方法: 卡氏白染色（熒光增白劑，CFW）:能與細(xì)胞壁物質(zhì)-葡萄糖苷鍵結(jié)合,能發(fā)出熒光.,電鏡觀察法:,新形成的細(xì)胞壁是排列松散的微纖絲組成的,微纖絲的合成是發(fā)生在質(zhì)膜的表面. 電鏡觀察發(fā)現(xiàn),原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時后,新壁開始形成,先是質(zhì)膜合成形成細(xì)胞壁主要成分的微纖絲,然后轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用,產(chǎn)生片層的結(jié)構(gòu),以后在質(zhì)膜與片層之間或在膜上產(chǎn)生纖微絲,逐漸形成不定向的纖維團(tuán),最后形成完整的細(xì)胞壁.,細(xì)胞壁的形成與細(xì)胞分裂有直接關(guān)系,凡是不能再生細(xì)胞壁的原生質(zhì)體也就不能進(jìn)行正常的有絲分裂.,2.細(xì)胞分裂與生長,一般原生質(zhì)體培養(yǎng)2-7天后,開始第一次分裂,但開始第一次分裂的時間隨植物

20、的種類,分離原生質(zhì)體的材料,原生質(zhì)體的質(zhì)量,培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異. 用幼苗的下胚軸和子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞、未成熟種子的子葉等為材料分離的原生質(zhì)體 ；一般比用葉肉分離的原生質(zhì)體容易誘導(dǎo)分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時間較快。,3.愈傷組織形成與分化,大多數(shù)情況下，原生質(zhì)體培養(yǎng)2周后，形成多細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，三周后形成肉眼可見的小細(xì)胞克隆，大約6周后形成直徑為2mm的小愈傷組織。 原生質(zhì)體培養(yǎng)7-10天后必須及時添加新鮮培養(yǎng)基，否則形成的細(xì)胞團(tuán)不繼續(xù)生長。待小愈傷組織長至1mm左右時應(yīng)及時轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上進(jìn)一步生長。,4.植株的再生,原生質(zhì)體形成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上可一步成苗。然而越

21、來越多實驗證明，兩步法成苗更適合大多數(shù)植物的原生質(zhì)體再生植株。即首先將愈傷組織培養(yǎng)于含低濃度生長素培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，再其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗。,六、原生質(zhì)體研究的趨勢,低密度和單個原生質(zhì)體培養(yǎng)； 原生質(zhì)體衍生系統(tǒng)如微小原生質(zhì)體、胞質(zhì)體、核質(zhì)體的利用； 單倍配子體如花粉原生質(zhì)體培養(yǎng)； 計算機(jī)控制系統(tǒng)、流式細(xì)胞光度計等技術(shù)的應(yīng)用。,第四節(jié)體細(xì)胞雜交,體細(xì)胞雜交是指兩個離體細(xì)胞通過一定誘導(dǎo)技術(shù)使質(zhì)膜接觸而融合在一起隨后導(dǎo)致兩個細(xì)胞核物質(zhì)融合的技術(shù)。 理論上說任何細(xì)胞,都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源,這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義.,Fusion phases o

22、f oat protoplasts (Avena sativa),A.融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制,為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供有效途徑; B.體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種,細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng),在雜種的分裂和增殖過程中，雙親的葉綠體、線粒體、DNA、亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。,根據(jù)融合時細(xì)胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為兩大類： 對稱融合（asymmetric fusion）即兩個完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。 非對稱融合（symmetric fusion）利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合，它可以分為幾種：,對稱融合示意圖,非對稱融合的附

23、圖,非對稱融合示意圖,物理方法常采用射線處理，如X射線、射線等，它們能使細(xì)胞核失活； 化學(xué)處理目前常用的試劑有: 核失活碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活羅丹明（R6G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達(dá)到失活的目的,用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類：,1978年德國科學(xué)家梅歇爾斯等人把馬鈴薯(potato)和番茄(tomato)的原生質(zhì)體融合獲得了體細(xì)胞雜種“泡馬豆”（pomato),一、融合方法,PEG誘導(dǎo)融合法 PEG的作用機(jī)理： 由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，當(dāng)PEG

24、分子鏈足夠長時，在相鄰原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連。與膜相連的PEG分子被洗掉后，膜上電荷發(fā)生紊亂而重新分配。當(dāng)兩層膜緊密接觸的區(qū)域電荷重新分配時，可能使一種原生質(zhì)體上的帶正電荷的基團(tuán)連接到另一種原生質(zhì)體的帶負(fù)電荷的基團(tuán)上，進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。,橋梁,示意 圖,PEG誘導(dǎo)融合的特點： 其優(yōu)點: 融合成本低，勿需特殊設(shè)備； 融合子產(chǎn)生的異核率較高； 融合過程不受物種限制。 其缺點: 融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。,融合液： CaCl22H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol

25、 甘露醇或山梨醇 0.51.0mol pH 5.6誘導(dǎo)液：融合液PEG 2045稀釋液：A液（g/100ml）pH6.0 B液（g/100ml）pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl22H2O 0.79 NaOH 0.169 DMSO（二甲亞砜） 10ml,P 1 融合液 P 2 混合靜止1min. 選 擇 P1 P2 加入PEG 培 養(yǎng) 融 合 加入稀釋液 加入培養(yǎng)基 稀 釋 洗 滌,2、電融合法 1979年：Senda首先實現(xiàn)原生質(zhì)體融合交流電使原生質(zhì)體排成串珠直流電使原生質(zhì)體質(zhì)膜發(fā)生不可逆擊穿,與PEG融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點： 一是不存在對細(xì)胞的毒害問題；

26、二是融合效率高； 三是融合技術(shù)操作簡便。 電融合儀的結(jié)構(gòu)特點： 一是交變電場部分； 一是高頻直流電擊部分。,電融合的基本過程： 細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串； 膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。 關(guān)于融合參數(shù)：電融合中的主要參數(shù)包括交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電場的處理時間；直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等。,電融合法原理,交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列

27、，形成串珠,施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流,二、原生質(zhì)體融合的過程,包括3個主要階段： 1、凝聚作用階段，其間兩個或兩個以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近； 2、在很小的局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合，在兩個原生質(zhì)體之間細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài)，或是出現(xiàn)橋； 3、由于細(xì)胞質(zhì)橋的擴(kuò)展，融合完成，形成球形的異核體或同核體。,三、影響原生質(zhì)體融合的因素,首先，原生質(zhì)體質(zhì)量對細(xì)胞的融合起著至關(guān)重要的作用，高質(zhì)量的原生質(zhì)體是細(xì)胞融合的首要條件。 其次，融合方法首選電融合、如果沒有條件進(jìn)行電融合，可以考慮PEG融合 其三是融合參數(shù)，包括各種融合液都應(yīng)選擇適當(dāng)。,原生質(zhì)體融合

28、后的培養(yǎng)同原生質(zhì)體培養(yǎng),四、雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)與雜種植株的鑒定1、 雜種細(xì)胞的篩選,原理：兩種親本細(xì)胞融合的混合物中可能有多種類型細(xì)胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞。 1）親本 2）同核體：同源原生質(zhì)體的融合體 3）異核體：非同源的原生質(zhì)體的融合體 4）多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體 5）異胞質(zhì)體：具有不同胞質(zhì)來源的雜合細(xì)胞。 6）核質(zhì)體：有細(xì)胞核而帶有少量細(xì)胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體,植物細(xì)胞篩選方式,1）遺傳互補(bǔ)篩選法： 利用每一親本貢獻(xiàn)一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。 如親本1：葉綠體缺陷型 親本2：光致死型 兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白 色，融合細(xì)胞

29、長成植株呈綠色，并能成長,2）抗性互補(bǔ)篩選法： 利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞。 如： 親本1：對放線菌素D抗性，但在MS培養(yǎng)基上不能超過50個世代 親本2：對放線菌素D很敏感，但能在MS上生長 雜種細(xì)胞能在含有放線菌素的MS培養(yǎng)基上生長，而親本和其它細(xì)胞死亡,3）利用物理特性篩選法： 根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細(xì)胞。 親本1：異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記 親本2：堿性蕊香紅熒光素標(biāo)記 在熒光顯微鏡下，親本1為綠色，親本2為紅色色，雜種細(xì)胞可以區(qū)分,4）利用生長特性篩選法： 利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。 例如粉蘭煙草與朗氏煙草細(xì)胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長，但其融合細(xì)胞可以產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加激素。,2、體細(xì)胞雜種的鑒定形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學(xué)性狀觀察進(jìn)行鑒定。細(xì)胞學(xué)鑒定：細(xì)胞器鑒定、染色體鑒定。生化鑒定：同功酶鑒定。分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標(biāo)記鑒定。,2-1、形態(tài)學(xué)比較再生植株與融合親本在形態(tài)上的異同,2-2、細(xì)胞學(xué)染色體形態(tài)和數(shù)目的比較,18條染色體,36條染色體,五、體細(xì)胞雜種的特點,形態(tài)上的趨中性 變異幅度大 非整倍性 雙親性狀的共顯性 偏親現(xiàn)象,六、體細(xì)胞雜種的