1、水質(zhì) 糞大腸菌群的測定,（多管發(fā)酵法） HJ/T347-2007 四川省城鎮(zhèn)供排水協(xié)會 曾蓉寧,2 水中微生物簡介,自然界的水可分為地下水和地面水，除了地下深層水外，如湖泊，河流，海洋等各種地面水中都存在著各種各樣的微生物。但它們所含的微生物種類，數(shù)量和分布都不相同。其中有些是“土生土長”的。另一些水生細(xì)菌是外來的，它們來自土壤，空氣，垃圾，工廠廢物或城市下水道污水。而來自下水道的微生物中，很可能含有人體腸道致病菌，例如霍亂，傷寒，副傷寒和痢疾等病原菌。,4 污水的細(xì)菌學(xué)檢驗,水質(zhì)的細(xì)菌學(xué)檢驗主要包括兩個常規(guī)項目：細(xì)菌總數(shù)和總大腸菌群。,5 總大腸菌群測定的兩種方法,多管發(fā)酵法 濾膜法,6 糞

2、大腸菌群的定義,糞大腸菌群是總大腸菌群的一部分，主要來自糞便。在44.5溫度下能生長并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的大腸菌群稱為糞大腸菌群。用提高培養(yǎng)溫度的方法，造成不利于來自自然環(huán)境的大腸菌群生長的條件，使培養(yǎng)出來的菌主要為來自糞便中的大腸菌群，從而更準(zhǔn)確地反映出水質(zhì)受糞便污染的情況。,7 適用范圍,本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水，地下水及廢水中糞大腸菌群的測定。,8 原理,多管發(fā)酵法是以最可能數(shù)（most probable number），簡稱MPN 來表示試驗結(jié)果的。實際上它是根據(jù)統(tǒng)計學(xué)理論，估計水體中的大腸桿菌密度和衛(wèi)生質(zhì)量的一種方法。如果從理論上考慮，并且進(jìn)行大量的重復(fù)檢定，可以發(fā)現(xiàn)這種估計有大于實際數(shù)字的

3、傾向。不過只要每一稀釋度試管重復(fù)數(shù)目增加，這種差異便會減少，對于細(xì)菌含量的估計值，大部分取決于那些既顯示陽性又顯示陰性的稀釋度。因此在實驗設(shè)計上，水樣檢驗所要求重復(fù)的數(shù)目，要根據(jù)所要求數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度而定。,9 培養(yǎng)基及試劑,本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑除另有說明，均為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑；實驗用水為新制備的去離子水。,10,單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液： 將10g 蛋白胨、3g 牛肉寖膏、5g 乳糖和5g 氯化鈉加熱溶解于1000mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液pH 為7.27.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于試管中，于115高壓滅菌器中滅菌20min，貯存于冷暗處備用。,11,三倍濃縮乳糖

4、蛋白胨培養(yǎng)液： 按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的制備方法配制。除蒸餾水外，各組分用量增加至三倍。（即按上述配方比例三倍（除蒸餾水外），配成三倍濃縮的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液）,12,EC培養(yǎng)液： 成分： 胰胨 20克， 乳糖 5克， 膽鹽三號 1.5克，磷酸氫二鉀（K2HPO4）4克，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.5克，氯化鈉5克，蒸餾水1000毫升。 制法：將上述成分加熱溶解，然后分裝于含有 玻璃倒管的試管中。置高壓蒸氣滅菌器中，115高壓滅菌器中滅菌20min，滅菌后pH應(yīng)為6.9。,13 培養(yǎng)基的存放,在密封瓶中的脫水培養(yǎng)基成品要存放在大氣濕度低，溫度低于30攝氏度的暗處，存放時應(yīng)避免陽光直接照射，并且

5、要避免雜菌傾入和液體蒸發(fā)。當(dāng)培養(yǎng)液顏色變化，或體積變化明顯時應(yīng)廢棄不用。,14 測定步驟,1. 水樣接種量的選擇 將水樣充分混勻后，根據(jù)水樣污染的程度確定水樣接種量。每個樣品至少用三個不同的水樣量接種。同一接種水樣量要有五管。 相對未受污染的水樣接種量為10ml、1 ml、0.1 ml。受污染水樣接種量根據(jù)污染程度接種1 ml、0.1 ml、0.01 ml、或0.1 ml、0.01 ml、0.001 ml等。,15,培養(yǎng)液的濃度和量的選擇： 如接種體積為10 ml，則試管內(nèi)應(yīng)裝有三倍濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液5mL；如接種量為1mL或少于1mL，則可接種普通濃度的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液10mL中。,16,

6、2. 初發(fā)酵試驗 將水樣分別接種到盛有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中。在370.5下培養(yǎng)24h2h。產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗陽性。入在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽性。,17,注意： 加入水樣時，先將培養(yǎng)管管口用酒精燈消毒一次，加入水樣后再用酒精燈消毒一次，封口。,18,陽性的判別：既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣： 觀察：24h小時后取出觀察培養(yǎng) 管，顏色由紫色變?yōu)辄S色和有 氣泡產(chǎn)生兩個方面才能判為陽性,19,3. 復(fù)發(fā)酵試驗 輕微震蕩初發(fā)酵試驗陽性結(jié)果的發(fā)酵管，用3mm接種環(huán)或滅菌棒將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到EC培養(yǎng)液中。在44.50.5下培養(yǎng)24h2h（水浴箱的水面應(yīng)高于試管中培養(yǎng)基液面）。接種后所有發(fā)

7、酵管必須在30分鐘內(nèi)放進(jìn)水浴中。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實為糞大腸菌群陽性。,20 結(jié)果的計算,根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目，從表2或表3中查得每升水樣中的糞大腸菌群。 接種水樣為100ml 2份，10ml 10份，總量300ml 時，查表2可得每升水樣中糞大腸菌群； 接種5份10ml 水樣，5份1ml水樣，5份0.1ml水樣時，查表3求得MPN指數(shù)，MPN值再乘10，即為1升水樣中的糞大腸菌群；,21,舉例： 某水樣接種10mL 的5 管均為陽性；接種1mL 的5 管中有2 管為陽性；接種1：10 的水樣1mL 的5 管均為陰性。從最可能數(shù)（MPN）表中查檢驗結(jié)果5-2-

8、0，得知100mL 水樣中的總大腸菌群數(shù)為49 個，故1L 水樣中的總大腸菌群數(shù)為4910=490 個。,22,如果接種的水樣量不是10mL、1mL 和0.1mL，而是較低或較高的三個濃度的水樣量，也可查表求得MPN 指數(shù)，再經(jīng)下面公式換算成每100mL 的MPN 值。,表2 大腸菌群檢數(shù)表接種水樣總量300mL(100mL2份，10mL10份),18,38,25 注意事項,滅菌 初發(fā)酵后以有陰、有陽稀釋效果最好。 水樣一定要搖均。 每個稀釋倍數(shù)要求做5管。 接種環(huán)要求用酒精燈灼燒消毒，復(fù)發(fā)酵接種時每一管都要在酒精燈上灼燒消毒。,26 思考題,配制好的培養(yǎng)基保存多少時間？存放時應(yīng)注意哪些事項？,27,答：配制好的培養(yǎng)基不宜保存過久，以少量勤配為宜。已滅菌的培養(yǎng)基可在4100C存放一個月。存放時應(yīng)避免陽光直射，并且避免雜菌侵入和液體蒸發(fā)。,28 填空題,1. 細(xì)菌采樣玻璃瓶洗滌干燥后，要在 0C干熱滅菌 或高壓蒸汽 0C滅菌 min。 2. 對受污染嚴(yán)重的水體，可選擇 方法測定其總大腸菌群數(shù)。 3. 總大腸菌群測定過程的復(fù)發(fā)酵試驗中，接