1、電穿孔簡介 Gene Pulser Xcell,1,學習交流PPT,電穿孔的工作原理是什么?,電穿孔的基本原理是將細胞置于一個瞬時的高電場的環(huán)境中，此高電場的環(huán)境使得細胞膜的表面出現(xiàn)很多小孔，這種條件下細胞膜對于環(huán)境中分子的透性大大增加，這樣就可以將外源分子進入細胞。 利用上述的原理，那么采用電穿孔的方法就可將DNA等其他類的生物分子導(dǎo)入細胞內(nèi)部進行研究，如蛋白分子、糖類分子等等。,2,學習交流PPT,采用電穿孔的優(yōu)點,本質(zhì)上屬于物理的方法，不采用任何化學試劑，因此不會對細胞產(chǎn)生損傷 操作方便 低毒性 高的轉(zhuǎn)染效率 使用于種類廣泛的細胞,3,學習交流PPT,電穿孔的主要應(yīng)用,導(dǎo)入標記基因，起到

2、標記、指示的作用 導(dǎo)入具體的功能基因進行研究 導(dǎo)入藥物、蛋白、抗體等其他分子對細胞的結(jié)構(gòu)和功能進行研究,4,學習交流PPT,具體的工作原理?,將細胞和外源DNA混合后一起放在電擊杯內(nèi) 電擊杯被加上電壓后，細胞膜進行重排，細胞表面出現(xiàn)很多小孔 外源DNA分子通過上述形成的小孔進行細胞內(nèi)部 當外界的電場撤消后，細胞膜表面的小孔重新關(guān)閉，這時阻止外界的分子再進入細胞,5,學習交流PPT,Gene Pulser Xcell電穿孔系統(tǒng),6,學習交流PPT,主要的優(yōu)點、特點,提供指數(shù)波和方波2種電穿孔條件，可對任何的真核細胞、原核細胞的電轉(zhuǎn)染實驗條件進行優(yōu)化 采用Bio-Rad專利的 PulseTrac電

3、路和電弧保護設(shè)計，可確保實驗的重復(fù)性并保護樣品 模塊化的設(shè)計可方便用戶根據(jù)不同的實驗要求進行選擇 友好的數(shù)字化界面，可直觀的編程控制所有的參數(shù)，包括附屬模塊的參數(shù) 提供多種操作模式，包括手動設(shè)置、預(yù)設(shè)模式、用戶編程等多種方式,7,學習交流PPT,主要的優(yōu)點、特點：2種波型,電穿孔的過程中可以有2種波型來控制外界電壓的變化 The Gene Pulser Xcell可以提供2種波型，即指數(shù)波和方波,8,學習交流PPT,Exponential Decay,電容器充電到預(yù)定的電壓(v0)放電后，即向樣品釋放脈沖，細胞表面的電壓隨時間按指數(shù)方式下降的 電容器的電壓值達到峰值釋放脈沖后迅速的衰減 電場強

4、度 E (V/cm) 是用來描述電擊杯外界電場環(huán)境的一個參數(shù)（E=V/d） 脈沖時間是一般用時間常數(shù)來進行衡量 (37% of V0， V0/e) 脈沖的時間是由電阻和電容的大小所決定的,9,學習交流PPT,GPX和指數(shù)波,GPX產(chǎn)生指數(shù)波的電路結(jié)構(gòu),Charger,充電回路,放電回路,電容器,電擊杯,3ohm 電阻,基本電路,10,學習交流PPT,GPX和指數(shù)波,GPX產(chǎn)生指數(shù)波的電路結(jié)構(gòu),Charger,充電回路,放電回路,電容器,電擊杯,3ohm 電阻r,充電,根據(jù)具體電壓及電容的選擇，可以采用主單元或者CE模塊對電容進行充電,11,學習交流PPT,GPX和指數(shù)波,GPX產(chǎn)生指數(shù)波的電路

5、結(jié)構(gòu),Charger,充電回路,放電回路,電容器r,電擊杯,3ohm 電阻,放電,The charge is delivered to the cuvette,12,學習交流PPT,PulseTrac 電路是如何確保每次實驗電壓的精確度及實驗的重復(fù)性,在每次放電前， PulseTrac電路都會預(yù)測整個放電回路的電阻值，并計算得到應(yīng)該加在電容器上的電壓，確保放電后樣品上獲得的電壓和理論電壓值的一致 在放電回路中3歐姆的電阻可以起到減小回路中電流的作用，適當?shù)谋Ｗo樣品 注意： PulseTrac 回路技術(shù)是Bio-Rad公司的專利技術(shù)，其他任何廠家都不能提供,13,學習交流PPT,PC模塊的結(jié)構(gòu)與

6、原理?,電流會經(jīng)過電阻最小的通路 PC模塊中的電阻決定了脈沖過程中的時間常數(shù)，電阻越小，放電時間越短,Charger,充電回路,放電回路,電容器,Cuvette,3ohm 電阻r,PC模塊,并聯(lián)電阻,當樣品的電阻遠遠大于PC模塊的電阻時，則PC模塊的電阻約等于放電回路的電阻,14,學習交流PPT,方波,電容器的指數(shù)放電過程中被截止后就會形成方波，其時間常數(shù)遠大于脈沖時間 脈沖時間就是細胞被放電的時間 脈沖是可以被反復(fù)釋放的，在低壓回路最多可以重復(fù)10次，在高壓回路最多可以重復(fù)2次 脈沖的間隔時間就是指2個脈沖間的時間 脈沖下降是指終止電壓和起始電壓值之間的差值,15,學習交流PPT,GPX和方

7、波,高電壓回路: 一次充電，一次脈沖。在下一次脈沖前，電容器需要重新充電 最多只能進行2次脈沖，脈沖時間為0.05 5msec，脈沖間隔為5-30sec 低電壓回路: 該電路是可調(diào)的，因此可一次充電，進行多次的脈沖 最多可進行10次脈沖，脈沖時間為0.05-100msec，脈沖間隔為 0.1 10 sec,16,學習交流PPT,特點: PulseTrac電路和電弧保護,PulseTrac電路確保樣品上所加電壓的精確度 將CE模塊中的低壓電容器的精度從20%提高到10% 電容器的校正方便，確保每次脈沖的精確，并且能修正隨著使用而產(chǎn)生的電容器指標的偏差 在每次脈沖前就能預(yù)測樣品的電阻 當脈沖或電路

8、中斷時，可進行安全的放電，確保安全 電弧保護設(shè)計，確保設(shè)備和樣品的安全,17,學習交流PPT,什么是電弧保護?,在電擊杯中出現(xiàn)電阻特別小的區(qū)域時，就會形成短路，產(chǎn)生電弧。樣品緩沖液中的離子成分就會造成電弧現(xiàn)象 只要上述電阻突然變小的情況被檢測到，那么電流就不會經(jīng)過樣品 電弧保護就是在存在短路的情況下，使電流不經(jīng)過樣品，確保樣品不受強電流的損傷 如果樣品量很少的話，那么產(chǎn)生的熱量會使得樣品蒸發(fā) 如果由于樣品的低電阻而產(chǎn)生電弧，那么GPX會給出提示，并不能提供脈沖,Ions collect above sample,18,學習交流PPT,特點: 模塊化設(shè)計,主機,CE模塊,PC模塊,ShockPo

9、d電擊槽,系統(tǒng)部件,19,學習交流PPT,特點: 友好的操作界面,圖表化的操作界面可以設(shè)置所有的實驗參數(shù)，包括附屬模塊的參數(shù),20,學習交流PPT,特點: 可選擇的程序設(shè)置,HOME 1. Exponential protocol 2. Time constant protocol 3. Square wave protocol 4. Pre-set protocols 5. User protocols,HOME 6. Last pulse 7. Optimize 8. Data management 9. Measurements 10. User preferences,主菜單,21,學

10、習交流PPT,1. 指數(shù)波,程序顯示,結(jié)果顯示,22,學習交流PPT,2. 時間常數(shù)確定的指數(shù)波形式,程序顯示,結(jié)果,23,學習交流PPT,3. 方波,程序顯示,結(jié)果顯示,24,學習交流PPT,4. GPX內(nèi)部預(yù)設(shè)程序,對于常規(guī)的細胞，經(jīng)過優(yōu)化的電穿孔條件,25,學習交流PPT,5. 用戶自儲存的程序,最多可儲存144個程序 12個人，每人12個程序 可按照名字儲存 可修改或刪除,26,學習交流PPT,6. 最后一次電穿孔的條件,即使關(guān)機后，GPX還是可以調(diào)出儀器最后一次電穿孔的條件，并利用該程序進行實驗。方便實驗室最常用程序的使用,27,學習交流PPT,7. 實驗條件的優(yōu)化,可用于方便的優(yōu)化

11、實驗條件，可連續(xù)的對脈沖條件中的電壓某一個參數(shù)進行優(yōu)化 該功能可在指數(shù)波、方波、特定時間常數(shù)的指數(shù)波模式下使用,28,學習交流PPT,8. 實驗數(shù)據(jù)管理,數(shù)據(jù)管理 可以調(diào)出之前的100個實驗程序 顯示每個程序的設(shè)置條件和結(jié)果,29,學習交流PPT,9. 儀器的測量功能,該功能使用戶可以在日常的工作中經(jīng)常對GPX CE模塊電路中的電容器進行校正，確保實驗的精確，具體的步驟如下： 斷開ShockPod電擊槽 連接CE模塊 按下操作面板上的小數(shù)點按鍵 在電擊前預(yù)測樣品的電阻 在實驗前，在電擊杯里加入樣品后放入ShockPod電擊槽內(nèi)，在 Resistance Measurement的菜單下按下“回車鍵”,30,學習交流PPT,10. 用戶可對GPX設(shè)置的參數(shù),用戶