1、、第二單元原料預(yù)處理技術(shù)、Company Logo、學習目標、1 .發(fā)酵液預(yù)處理的目的和主要方法及其原理。 2 .常用的細胞破碎方法和原理。 3 .生物分離中常用的離心過濾方法。 Company Logo，第一節(jié)概括了微生物發(fā)酵和動植物細胞培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液(或培養(yǎng)液)中除了存在必要的生物活性物質(zhì)以外，還存在大量菌體、細胞、細胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物及其馀培養(yǎng)基成分等。 Company Logo，通常的處理方法是將菌體、細胞、固體培養(yǎng)基等固體懸浮粒子和可溶性成分分離(即固液分離)，然后進行后續(xù)的分離純化操作單元。 對于細胞內(nèi)生成物，應(yīng)該在經(jīng)過細胞破碎使生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐合嘀?，通過固液分離去除細胞碎片

2、等固體雜質(zhì)。 Company Logo，常用的固液分離方法主要是過濾和離心。 但是，不同來源的培養(yǎng)液和發(fā)酵液固液分離速度差異很大，根據(jù)該介質(zhì)的理化性狀，主要是細胞或菌體的大小和介質(zhì)的粘度。 細胞凝集技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的有效方法。 Company Logo、發(fā)酵液中雜質(zhì)多，對后續(xù)分離影響最大的是昂貴的無機離子(Ca2、Mg2、Fe3)和雜蛋白等。 預(yù)處理時，請盡量把這些物質(zhì)拿出來。Company Logo，第二節(jié)前處理的目的和方法，一、前處理的目的是改變發(fā)酵液的物性，促進從懸浮液中分離固體物質(zhì)的速度，提高固液分離器的效率。 盡量將生成物轉(zhuǎn)移到容易后處理的某一相(多為液相)。 去除發(fā)酵液中雜質(zhì)的

3、一部分，使之后的各工序的操作變得容易。公司記錄、二、預(yù)處理方法、1、加熱方法的關(guān)鍵在于產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性。 是最簡單廉價的預(yù)處理方法，加熱可以降低懸浮液的強度，加速凝聚作用，去除某些蛋白質(zhì)雜質(zhì)，破壞凝膠狀結(jié)構(gòu)，增加蛋糕的孔隙率，使固液分離變得容易。 Company Logo，2 .調(diào)節(jié)懸浮液pH值的方法也很簡便。 全細胞的凝集作用取決于pH值的大小，適當?shù)膒H促進凝集作用，一般由草酸、無機酸或堿來調(diào)節(jié)。 Company Logo，3 .凝聚和凝聚是懸浮液預(yù)處理的重要方法。 均將化學藥品投入懸浮液中，改變細胞、菌體、蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，損害其穩(wěn)定性，收集到可分離的絮凝物中進行分離。 Comp

4、any Logo、凝聚和凝聚可有效增加顆粒大小，增加顆粒沉降或浮選速度，提高濾餅的滲透性，或在深層過濾時產(chǎn)生良好的顆粒保留作用。 深層過濾：雖然粒子尺寸比介質(zhì)的細孔直徑小得多，但是細孔彎曲細長，粒子進入后容易被阻斷，通過流體流動時引起的壓迫和沖擊作用，粒子附著在細孔的壁面上，這種過濾在介質(zhì)內(nèi)部進行，介質(zhì)表面沒有形成蛋糕。 Company Logo、凝聚和凝聚：投入的化學物質(zhì)(如水解的凝聚劑、鋁、鐵的鹽類和石灰等)使膠體脫穩(wěn)定，使粒子之間凝聚成1mm大小的塊狀凝聚體的過程。 絮凝劑的作用：中和粒子表面電荷； 去除雙電層，以脫穩(wěn)定的氫鍵或其他復(fù)雜的形式與粒子結(jié)合凝聚。 Company Logo，凝

5、聚和凝聚：使用凝聚劑(通常是天然或合成的大分子質(zhì)量電解質(zhì))將膠體粒子交聯(lián)在網(wǎng)絡(luò)上，形成10mm大小的凝聚團的過程。 絮凝劑的作用：架橋作用。 您可以選擇進行集聚過程、凝聚過程、凝聚過程、凝聚過程、凝聚過程、凝聚過程。 最佳凝聚劑使用量是粒子表面的約一半被聚合物復(fù)蓋時使用的凝聚劑使用量。 Company Logo，凝聚劑和凝聚劑的類型，凝聚劑：主要是無機系電解質(zhì)，多為陽離子型，有無機鹽類、金屬氫氧化物類和聚合無機鹽類等。凝聚劑：其官能團分為陰離子、陽離子、非離子3種。 Company Logo，4 .去除雜蛋白的其他方法，等電沉淀法蛋白在等電點溶解度最小，可以去除沉淀。 多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點在酸性

6、范圍內(nèi)(pH為4.0-5.5 )。 有些蛋白質(zhì)在等電點也有溶解度，可與其他方法結(jié)合。 Company Logo將改性沉淀蛋白質(zhì)從規(guī)則序列變化為不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過程稱為改性，改性蛋白質(zhì)在水中的溶解度小，產(chǎn)生沉淀。 方法：加熱、pH大幅度改變、有機溶劑(丙酮、乙醇等)、加權(quán)金屬離子(Ag、Cu2、Pb2等)、有機酸(三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、單寧酸、高氯酸等)及表面、Company Logo、吸附作用始終為雜蛋白發(fā)酵液中加入反應(yīng)劑后，它們相互反應(yīng)生成的沉淀物對蛋白質(zhì)有吸附作用而凝固。 Company Logo，5 .去除不溶性多糖，多不溶性多糖時，發(fā)酵液粘度增大，固液分離困難，用酶轉(zhuǎn)化為單糖，提高過濾

7、速度。 蛋白質(zhì)組學發(fā)酵液中加入淀粉酶，可將培養(yǎng)基中多才淀粉水解為單糖，降低發(fā)酵液的粘度，提高濾速。 Company Logo，6 .除去昂貴的金屬離子，影響產(chǎn)品質(zhì)量的無機雜質(zhì)主要是Ca2、Mg2、Fe3等昂貴的金屬離子，在預(yù)處理中應(yīng)該除去它們。 Company Logo，1，概念細胞破碎是一種以物理、化學、酶和機械方式破壞細胞壁和細胞膜的方法。 所謂細胞破碎技術(shù)，就是利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)容物釋放出含有目標物的成分的技術(shù)。 2 .目的破壞細胞周邊，釋放細胞內(nèi)容物。 第三節(jié)細胞破碎技術(shù)，Company Logo，3 .原理細胞結(jié)構(gòu)細胞壁的破碎最為重要。 動物細胞沒有細胞壁，容易破碎

8、。 植物和微生物細胞的細胞壁堅固，破碎困難。Company Logo、細菌革蘭陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖層構(gòu)成，細胞壁厚為15-50nm。 革蘭氏陰性菌的細胞壁在肽聚糖的外側(cè)有由脂蛋白、脂多糖和磷脂構(gòu)成的2層外壁層，肽聚糖層為1.5-2nm，外壁層為8-10nm。 因此，革蘭氏陽性菌的細胞壁比革蘭氏陰性菌堅固，難以破碎。Company Logo，細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成，圖3.1細胞外層結(jié)構(gòu)，Company Logo，真菌和酵母細胞壁呈絲狀，比革蘭陽性菌的細胞壁厚，約60nm，更難破碎。 霉菌細胞壁較厚，100-250nm。 哺乳類細胞、嗜鹽菌和支原體哺乳類細胞和嗜鹽菌沒有硬細胞壁，支原體沒有細胞壁

9、，容易破碎。 Company Logo，藻類細胞壁復(fù)雜，其主要成分為纖維狀多糖物質(zhì)。Company Logo，細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成、各種微生物細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成、Company Logo，細胞破碎和產(chǎn)物釋放原理、細胞破碎主要采用各種機械破碎法和化學破碎法，或者結(jié)合。 機械破碎中細胞受到的機械作用力主要有壓縮力和剪切力。 化學破碎也稱為化學滲透，利用化學和生化試劑(酶)改變細胞壁和細胞膜的結(jié)構(gòu)，提高細胞內(nèi)物質(zhì)的溶解速度。 或者細胞壁完全溶解形成原生質(zhì)體后，滲透壓使細胞膜破裂釋放細胞內(nèi)物質(zhì)。 Company Logo，破碎方法，細胞破碎機制，二，細胞破碎法，細胞破碎方法分類，Company Logo

10、，細胞壁破碎，破碎方法的選擇：破碎目的破碎對象生物的類型破碎目的：取得產(chǎn)品，研究細胞內(nèi)產(chǎn)物在體內(nèi)的功能，考慮破碎產(chǎn)率和能耗破碎的生物類型：不同生物對破碎的靈敏度不同，Company Logo、細胞壁的破碎、細胞破碎的靈敏度、生物大小、形態(tài)、齡期、品種、生長條件、細胞壁結(jié)構(gòu)、pH、溫度和細胞的變化也影響破碎的靈敏度。Company Logo，1 .機械破碎方法，HC23-高壓細胞破碎機，高壓均質(zhì)法，DY89-1型電動玻璃均質(zhì)器，Company Logo，作用機理：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座和閥門之間的環(huán)隙高速的高壓均質(zhì)器的操作高壓均質(zhì)法，Company Logo，1 .機械破碎方法，影響細胞破

11、碎的因素：溫度壓力循環(huán)操作次數(shù)細胞濃度閥座形式，高壓均質(zhì)法，Company Logo，影響破碎效率的因素，溫度：破碎率隨溫度增加高溫有利于破碎，但熱改性壓力適用于酵母和細菌細胞的破碎，高壓均相法，Company Logo，1 .機械破碎方法，珠磨概略圖，珠磨法，生產(chǎn)廠家：瑞士WAB公司德國西門子機械公司型號：立式(效率高)，Company Logo，原理：攪拌珠磨機法、Company Logo、珠磨機主體：一般為縱型和橫型的圓筒型腔，橫型的破碎效率比縱型珠磨機高：因為在縱型機中向上流動的液體在某種程度上使研磨珠流動化，使其研磨效率降低。 研磨珠：玻璃(密度2.5gcm3)或氧化鋯(密度6.0

12、gcm3)微球(粒徑約0.110mm )、填充率8085。 Company Logo，1 .機械破碎方法，動力學方程式：一次動力學方程式，珠磨法，R:t時間內(nèi)能夠釋放的蛋白質(zhì)的數(shù)量(mg/g) Rm :能夠釋放的蛋白質(zhì)的最大數(shù)量，即100破碎k :遵循破碎速度常數(shù)的1 .機械破碎方法， 影響破碎效率的因素：轉(zhuǎn)臺外緣速度細胞濃度玻璃珠大小和裝載量溫度流速、玻璃珠磨法、Company Logo，1 .機械破碎方法、玻璃珠磨法破碎過程產(chǎn)生大量熱能，修訂時需要考慮熱交換問題。 適用于大部分真菌菌絲和藻類等微生物細胞的破碎。 影響破碎率的操作殘奧表很多，操作過程的優(yōu)化設(shè)定很復(fù)雜。 珠磨法，Company

13、 Logo，1 .機械破碎方法，原理：細胞為彈性體，比一般的剛性固體粒子更難破碎。 使彈性細胞凍結(jié)成剛性球體，降低破碎難度的沖擊破碎就是基于這樣的原理。 操作：將細胞懸浮液高速凍結(jié)成噴霧狀(凍結(jié)速度為每分數(shù)千度)，形成粒徑小于50um的微粒子。 高速載氣(例如氮氣、氣流約300m/s )將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊碰撞板，破碎凍結(jié)的細胞。 沖擊破碎法，Company Logo，1 .機械破碎方法，特點：細胞破碎只發(fā)生在碰撞板的瞬間，細胞破碎是均勻的，可以避免因反復(fù)受力而過度破碎的現(xiàn)象。 細胞破碎的程度可以通過無級調(diào)節(jié)載氣的壓力(流速)來控制，避免細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，主要用于細胞器(如線粒

14、體、葉綠體等)的回收。 沖擊破碎適用于微生物細胞和植物細胞的破碎。 沖擊破碎法，Company Logo，1 .機械破碎方法，JY92-型超聲波細胞破碎機，超聲波法，Company Logo，1 .機械破碎方法，作用機理：超聲波對液體產(chǎn)生氣蝕作用的超聲波的細胞破碎效率與細胞的種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)超聲波法，Company Logo，1 .機械破碎方法，超聲波的負面影響： 1，溫度上升：懸濁液預(yù)冷，夾套冷卻短期冷卻和短期破碎交替。2 .超聲波處理引起自由基那樣的化學效果，破壞目標物，加入自由基去除劑(組氨酸、谷胱甘肽等)可以去除。 3 .影響因素：聲強、聲音、溫度、時間、離子強度、p

15、H、細胞類型。 超聲波法，Company Logo，1 .機械破碎方法，機械破碎細胞的優(yōu)缺點：內(nèi)容物總釋放時間短，效率高，成本低通用性強，適合實驗室和工業(yè)生產(chǎn)的缺點：需要高能量，產(chǎn)生高溫、高剪切力， 產(chǎn)品變性不全2 .化學和生化滲透法(非機械法)，作用機理：用化學試劑溶解細胞壁或提取細胞中某些成分的處理方法：酸堿處理； 化學試劑表面活性劑； 有機溶劑EDTA螯合劑； 改性劑，化學滲透法，Company Logo，2 .化學和生化滲透法(非機械法)，酸堿處理調(diào)節(jié)pH，改變蛋白質(zhì)的帶電性，提高生成物的溶解度。 化學試劑處理可以用表面活性劑和有機溶劑(甲苯)處理細胞，增大細胞壁的滲透性，降低細胞內(nèi)產(chǎn)

16、物的相互作用，使之容易釋放。 Company Logo，2 .化學和生化滲透法(非機械法)，優(yōu)點：產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，不需要特殊設(shè)備細胞外形完整，細胞碎片少，漿液粘度低，有利于后續(xù)分離，化學滲透法，缺點：通用性差時間長2 .化學和生化滲透法(非機械法)， 應(yīng)用：細胞內(nèi)酶活性釋放細胞內(nèi)物質(zhì)的檢測研究，化學滲透法，Company Logo，2 .化學和生化滲透法(非機械法)，作用機理：酶溶解法(enzyyy溶菌酶適用于革蘭陽性菌細胞壁的分解，應(yīng)用于革蘭陰性菌時，必須輔助EDTA使細胞壁更有效地作用真核細胞的細胞壁與原核細胞不同，需要使用不同的酶。 酵母細胞的酶溶解需要Zymo1yase (幾種細菌酶的混合物)、- 1，6 -葡聚糖酶(或者甘露糖酶)，破壞植物細胞壁需要纖維素酶。 酶法細胞溶解，Company Logo，2 .化學和生化滲透法(非機械法)，優(yōu)點：產(chǎn)品