1、第7章蛋白質的分離、純化和表征，第7章蛋白質的分離、純化和表征，1。蛋白質的酸堿性質。蛋白質分子中有許多酸性和堿性解離基團，是具有兩性解離性質的化合物。各種離解基團的離解程度與溶液的酸堿度有關。酸堿度越低，堿性解離度越大，蛋白質分子的正電荷越多，負電荷越少。隨著酸堿度的增加，解離是相反的。等電點(pI):在特定的酸堿度條件下，蛋白質分子的正電荷和負電荷相等，靜電荷為零。這種酸堿度被稱為蛋白質的。等電點不是一個恒定值，它會因溶液中鹽的種類和離子強度的影響而不同。蛋白質在純水溶液中的荷電狀態(tài)完全由氫的離解和結合決定，在這種情況下的等電點稱為血漿點。血漿點是蛋白質的特征常數(shù)。2.蛋白質分子大小和分子

2、量的測定。蛋白質的分子量范圍為61031106 Da。測定蛋白質相對分子量的原理和方法也可以用同樣的原理來計算蛋白質的最小分子量。(2)用滲透壓法測定相對分子量，以及用滲透壓法測定核磁共振法的缺點：無法確定溶液中的蛋白質分子是否均勻。(3)用沉降分析法測定磁流變液。在強離心場中，如果蛋白質溶液的密度高于溶液的密度，溶液中的蛋白質就會沉淀。沉降速率取決于蛋白質的分子量、密度和形狀，以及溶劑的密度和粘度。沉降系數(shù)(20，w):單位離心場強的沉降速度。定義110-13秒(Svedberg單位)。Mr=RTSD(1V)，沉降速度法，其中：s3360是沉降系數(shù)，D3360是擴散系數(shù)，3360是溶劑密度，

3、v:是蛋白質的部分微分比容。將純分析樣品置于離心池中，以低速(8000-10000轉/分)長時間離心，使蛋白質顆粒沉降形成濃度差，擴散使樣品顆粒從高濃度區(qū)擴散到低濃度區(qū)，最終達到沉降和擴散的平衡狀態(tài)。Mr=2RTln(C2/C1)2(1v)(x22x12)，沉降平衡法，角速度： V:部分比容：體積密度x1，x2:蛋白質濃度；(4)采用凝膠過濾法測量核磁共振，凝膠過濾(色譜法)可以根據(jù)蛋白質的分子量進行分離，同時可以測量蛋白質的分子量。通常，交聯(lián)葡聚糖(商品名為葡聚糖凝膠)用于測量蛋白質的核磁共振。蛋白質通過凝膠柱的速度，即洗脫體積，與其分子量有關，分子量為33，360。首先，測量幾種標準蛋白質

4、的Ve，并相對Ve繪制其分子量對數(shù)以獲得直線。然后，通過檢查標準曲線可以確定待測樣品的分子量。(5)磁共振采用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定，具有較高的分辨率。它主要是根據(jù)各蛋白質組分電泳遷移率的差異來分離和檢測蛋白質混合樣品。這種差異主要與蛋白質分子的凈電荷、分子量和形狀有關。當電泳系統(tǒng)含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)時，電泳遷移率僅取決于蛋白質的分子量，因此蛋白質的分子量可以直接從電泳遷移率計算出來。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-page)，0.51.0，KD 330 220 67 60 36 18.5，KD 94 67 43 30 20.1 14.4，摩爾質量KD 300 200 100 8

5、0 60 50 40 30 20 10，遷移(射頻)，Pharmacia :電泳分子標記，1蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質顆粒的大小屬于膠體顆粒的范圍(1-100納米)。因為它的分子表面有許多極性基團，所以它是高度親水的，易溶于水，成為穩(wěn)定的親水膠體溶液。蛋白質膠體的穩(wěn)定性主要取決于兩個因素：雙電層的水合層、廷德爾效應、布朗運動、半透膜的不滲透性、膠體性質和蛋白質沉淀，蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的和相對的。如果環(huán)境條件改變，水合膜和雙電層被破壞，蛋白質水膠體將失去其穩(wěn)定性并絮凝沉淀，這就是所謂的蛋白質沉淀。鹽析：中性鹽(NH4SO4、NaSO4、氯化鈉等)。)蛋白質去除水合層。優(yōu)點：它不會引起蛋白質變性。鹽析：蛋白質在稀鹽溶液中溶解度增加的現(xiàn)象。有機溶劑沉淀法：極性有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮)去除水合層，降低介電常數(shù)，增加帶電粒子間的相作用。條件：低溫操作縮短時間。重金屬鹽沉淀法