1、第五章、中藥制劑中各類化學(xué)成分的分析,內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥物分析教研室,第一節(jié) 生物堿類成分分析,一、概述 生物堿是生物界除生物體必須合成的含氮化合物之外的所有含氮的有機(jī)化合物，因其結(jié)構(gòu)中氮原子上的未共用電子對(duì)而大多呈堿性。,小檗堿(berberine),苦參堿(matrine),N,延胡索乙素(corydalis),二、結(jié)構(gòu)特性和理化性質(zhì) （一）結(jié)構(gòu)特性 大多含有C，H，N，O組成 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)構(gòu)類型較多 氮原子有多種形式 有羧基,酚羥基等酸性官能團(tuán)及酯鍵取代,(二)理化性質(zhì) 1. 物理性質(zhì) 多為結(jié)晶型固體，少數(shù)為液體 一般生物堿為白色或無色，但結(jié)構(gòu)中具有較長共軛體系，并有助色團(tuán)的可顯不同顏色 旋

2、光性與勝利活性相關(guān)，左旋體比右旋體生理活性強(qiáng),生物堿的酸性水溶液或稀醇溶液,硅鎢酸,磷鎢酸,磷鉬酸,(BH+)4Si(W3O10)4 (淡黃色或灰白色),3BHPO412WO32H2O（白色至褐色）,3BH3PO412MoO32H2O （白色至黃褐色,加氨水轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色）,3. 沉淀反應(yīng),4.呈色反應(yīng),5.堿性 生物堿堿性強(qiáng)弱是中藥制劑分析時(shí)供試品溶液制備、某些分析方法建立及條件選擇的依據(jù)。,+ 酸性染料,有色配合物,一定pH值,三、定性鑒別 （一）一般理化鑒別 沉淀反應(yīng)是生物堿最常用的鑒別方法。 有些成分也可與試劑生成沉淀而造成假陽性結(jié)果。,(二) 色譜鑒別 1薄層色譜法,溶劑提取,濃縮,凈化

3、,層析,生物堿顯色劑,顏色反應(yīng)或熒光,供試品,生物堿,點(diǎn)樣,+,如用硅膠為吸附劑時(shí),一般應(yīng)用堿性系統(tǒng)展開劑較多,或使生物堿的薄層分離在堿性環(huán)境下進(jìn)行。,注意,2紙色譜法 多為薄層色譜所代替， 利用多緩沖紙色譜來快速鑒別烏頭中雙酯類生物堿和醇胺類生物堿有其獨(dú)到之處。,3高效液相色譜法 在恒定的高效液相色譜條件下，各種生物堿都具有一定的保留時(shí)間，可作為定性鑒別的參數(shù)。一般要求取得兩個(gè)色譜系統(tǒng)的保留時(shí)間，或應(yīng)用二級(jí)管陣列檢測(cè)器作出鑒定,四、含量測(cè)定 (一)總生物堿含量測(cè)定 1.化學(xué)分析法 包括重量分析和容量分析 主要使用酸堿滴定法,酸堿滴定法： a.游離生物堿不溶于水，可先將生物堿溶于過量標(biāo)準(zhǔn)酸溶液

4、中,再用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液回滴 b.生物堿鹽在水或乙醇介質(zhì)中，用強(qiáng)酸溶液滴定。一般使其溶于90乙醇溶液中，可用標(biāo)準(zhǔn)酸乙醇液滴定，用酚酞作指示劑。,重量分析法： （1）將生物堿從中藥制劑中提取，用適宜的方法使其生成沉淀，干燥后直接稱重 優(yōu)點(diǎn): 計(jì)算簡(jiǎn)便，不用換算因數(shù)，不必考慮生物堿的分子量。,缺點(diǎn) 揮發(fā)性生物堿，蒸發(fā)提取溶劑或加熱、干燥時(shí)能分解破壞以及加堿使生物堿游離時(shí)可發(fā)生水解的生物堿不可用此法。 取樣量大，操作時(shí)易乳化，費(fèi)時(shí)。,（2）加入某些試劑，使生物堿生成不溶性沉淀，稱量沉淀,計(jì)算生物堿的含量。 優(yōu)點(diǎn)： 取樣量少，靈敏度高。 缺點(diǎn) 繁瑣，影響因素多，干擾多。,2. 分光光度法： （1）直接測(cè)定法

5、 利用生物堿自身的光吸收直接進(jìn)行比色測(cè)定的方法。 一般用于藥味較少，干擾不大的中藥制劑中生物堿的含量測(cè)定。,（2）離子對(duì)萃取比色法 原理： 在一定的pH介質(zhì)中，有機(jī)堿與一些酸性染料或磺酸類、酸類的陰離子，定量的結(jié)合為有色離子對(duì)，此離子對(duì)可定量的溶于某些有機(jī)溶劑，然后在一定的波長下測(cè)定有機(jī)溶劑或經(jīng)堿化后釋放的染料的吸收度。,1.酸性染料比色法：,本法測(cè)定的關(guān)鍵在于 介質(zhì)的pH值， 酸性染料的性質(zhì)， 有機(jī)溶劑的性質(zhì)。,2.苦味酸鹽法： 凡是在弱酸或中性溶液中能與苦味酸定量發(fā)生沉淀的生物堿,都可按本方法測(cè)定含量。 a.是濾取生物堿-苦味酸鹽沉淀，加堿使生物堿-苦味酸鹽解離，然后以有機(jī)溶劑提出生物堿，

6、將苦味酸的堿性水溶液進(jìn)行比色，再換成生物堿的含量。,b. 在pH為7的緩沖液中，使生物堿與苦味酸結(jié)合成鹽，用氯仿提取此鹽，然后再以pH為11的堿性緩沖液使氯仿中苦味酸鹽解離，并將苦味酸提取到堿性水溶液中再進(jìn)行比色。 c.直接在pH為45的緩沖溶液中，用氯仿提取生物堿苦味酸鹽，將氯仿提取液直接進(jìn)行比色。,3.雷氏鹽比色法： 生物堿與雷氏鹽生成沉淀后，將沉淀分離，溶于丙酮，于520526nm波長處比色測(cè)定吸收度，換算生物堿的含量。 生物堿的雷氏鹽沉淀的丙酮溶液所呈現(xiàn)的吸收特征，是由于分子結(jié)構(gòu)中的硫代氰酸鉻銨部分，而不是結(jié)合的生物堿部分，其吸收值與樣品或溶劑無關(guān)。,硫代氰酸鉻銨在丙酮中的克分子吸收系

7、數(shù)為106.5(單鹽)或213.0(雙鹽)。故可根據(jù)其吸收值A(chǔ)按下式直接測(cè)得樣品重 W =（ A/）MV/1000 本方法可不需要標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，但需注意生物堿生成單鹽或雙鹽，并要注意樣品的凈化。,(二)單體生物堿含量測(cè)定 1薄層色譜法 薄層色譜技術(shù)在生物堿類成分分離和測(cè)定須結(jié)合生物堿的通性選擇合適的提取溶劑制成供試品溶液，需要采用化學(xué)方法提取和純化，常用液-液萃取或液-固萃取，或結(jié)合生物堿的特性進(jìn)行純化。常使用堿性展開劑或在堿性氣氛中展開。在薄層直接掃描定量,時(shí)，須首先作一工作曲線，目的是考察工作曲線是否為通過原點(diǎn)的直線，以便決定采用外標(biāo)一點(diǎn)法或外標(biāo)兩點(diǎn)法進(jìn)行定量，其次需要找出線性范圍，以便摸索

8、樣品點(diǎn)樣量。采用薄層直接掃描定量還需要隨行對(duì)照品進(jìn)行，同時(shí)要考察穩(wěn)定性，同板、異板效應(yīng)和精密度等。,2高效液相色譜 生物堿類成分進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)，可采用正相、反相和離子對(duì)色譜，其中以反相高效液相色譜應(yīng)用較多。,為了克服游離硅醇基的影響 : (1)流動(dòng)相方面的改進(jìn)： a.加入硅醇基抑制劑，最常用的硅醇基抑制劑是三乙胺; b.在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑; c.在流動(dòng)相中加入季銨鹽試劑，例如在水-甲醇流動(dòng)相中加入0.01molL的溴化四甲基胺。,(2)固定相方面的改進(jìn)： 封尾技術(shù)可以使填料的檢核更徹底。 鍵和反應(yīng)結(jié)束后，用三甲基硅氯烷等進(jìn)行后續(xù)處理，盡量減少參與羥基，增加單體覆蓋度。,第二節(jié)黃酮

9、類制劑的分析,（一）概述 黃酮類化合物為自然界廣泛存在的一大類化合物，多具有顏色，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成甙，一部份以游離形式存在。,蘆丁(rutin),黃芩苷(baicalin),槲皮素(quercetin),二、結(jié)構(gòu)特征與理化性質(zhì) （一）結(jié)構(gòu)特征 基本母核為2苯基色原酮，現(xiàn)泛指兩苯環(huán)通過中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一類化合物。,（二）理化性質(zhì) 1.物理性質(zhì)：多數(shù)為結(jié)晶性固體 2.溶解度 3.酸堿性：具有酚羥基，顯酸性 4.顯色反應(yīng)：與分子中酚羥基及-吡喃酮環(huán)有關(guān)。 5.紫外吸收,一、定性鑒別 定性分析方法主要有 化學(xué)顯色反應(yīng) 薄層色譜,(一)化學(xué)顯色反應(yīng) 1.還原反應(yīng) 鹽酸-鎂粉反應(yīng)顯色反應(yīng)

10、的機(jī)理是黃酮類成分經(jīng)還原反應(yīng)后生成花色甙元及其二聚物。,操作： 取樣品液510mL，加入數(shù)滴鹽酸，然后加入少許鎂粉，如果有黃酮、黃酮醇或其二氫化合物存在，數(shù)分鐘后則可產(chǎn)生橙色或紅色。必要時(shí)，需作空白試驗(yàn)。,2與金屬鹽類試劑的配合反應(yīng) 黃酮類成分能與金屬離子如Al3+，Zr4+等產(chǎn)生絡(luò)合作用，產(chǎn)生熒光或顏色加深等。 配合作用的條件是黃酮類成分必須具備下述條件之一者，即5-羥基(a)、3-羥基(b)或鄰二酚羥基(c)，(a)、(b)都是羥基與4位羰基共同與金屬離子形成絡(luò)合物的。,(三)薄層色譜法 黃酮類成分的薄層定性，一般采用吸附薄層，常用的吸附劑有硅膠與聚酰胺，也有用纖維素、硅酸鎂、氧化鎂。硅膠

11、色譜分離弱極性化合物較好；聚酰胺色譜分離含游離酚羥基的黃酮及其甙頗為理想；而纖維素薄層則適用于分離多糖甙混合物。展開后的顯色反應(yīng)可采用在紫外光下觀察熒光和噴顯色劑相配合的方法。,1硅膠薄層色譜 硅膠分離黃酮成分遵循正相色譜層析規(guī)律，化合物極性越強(qiáng)，所需溶劑的極性越大。 其Rf值順序如下： RCH3RHROCH3R-O-糖ROH,常用的溶劑系統(tǒng)有： 甲苯-甲酸乙酯-甲酸(541)，分離黃酮甙元 苯-甲醇(955)，分離黃酮甙元； 苯-甲醇-乙酸(3555)，分離黃酮甙； 氯仿-甲醇(82)，分離黃酮甙元及甙；,苯-乙酸乙酯(7.52.5)或苯-丙酮(91)，分離黃酮甙元衍生物如甲醚或乙酸酯中性成

12、分； 甲苯-甲酸乙酯-甲酸(541)，分離雙黃酮成分。 溶劑系統(tǒng)中各組分的配比可根據(jù)薄層色譜的需要加以調(diào)整。,供試液制備 取本品粉末0.5g,加50乙醇30ml置水浴上回流30分鐘,放冷,濾過,濾液蒸干乙醇后,加水少量溶解,加至聚酰胺小柱上,先后用水,乙醇各l00ml洗脫,收集乙醇洗脫液,蒸干,殘?jiān)靡掖既芙?使成1ml,作為供試品溶液。,淫羊藿的鑒別,例,對(duì)照液制備: 0.5mg/mL 。 薄層板：硅膠G自制板；厚度：250m 點(diǎn)樣：供試品10L，對(duì)照品2L 展開劑：醋酸丁酯-甲酸-水(1.311) 展開方式：平衡15分鐘；上行展開8cm,顯色： 5%AlCl3乙醇溶液,紫外光燈下檢視。 色

13、譜識(shí)別 與淫羊藿甙對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)。 注意事項(xiàng) 溫度在25以上；控制濕度在18-47范圍內(nèi)色譜效果較好.,1 2 3 4 5 6 樣品： 1.淫羊藿甙 2.淫羊藿 3.箭葉淫羊藿 4.朝鮮淫羊藿 5.柔毛淫羊藿 6.巫山淫羊藿,2聚酰胺薄層色譜 聚酰胺薄層色譜用于分離含游離酚羥基的黃酮甙與甙元較好。由于各種黃酮類成分取代基團(tuán)的性質(zhì)、多少和位置的不同，與聚酰胺形成氫鍵的能力有所差異而得到分離。,展開劑中大多含醇,酸,水,或二者兼有。 常用的溶劑系統(tǒng)有： 甲醇-水(82), 分離黃酮甙元及甙， 乙醇-水-乙酰丙酮(241),水-乙醇-丁酮-乙酰丙酮(13331),苯-丁

14、酮-甲醇(622), 分離黃酮甙元； 甲酸-甲醇-乙酸乙酯(1218), 乙酸-水(12), 分離黃酮甙。,鼻炎康片中黃芩甙的薄層色譜 取片劑細(xì)粉，加50乙醇于60水浴中熱浸30分鐘，濾過，取濾液點(diǎn)于聚酰胺薄膜上，用36醋酸展開，以黃芩甙為對(duì)照品，展開后于紫外燈下觀察（365nm)，黃芩甙呈紫色斑點(diǎn)，Rf值約為0.30。,3纖維素薄層色譜 用于分離黃酮甙類較好， 原理與紙色譜相同， 色譜流動(dòng)相可用紙色譜所有的流動(dòng)相。,a.黃酮類成分的纖維素色譜行為是：分子中酚羥基增多時(shí)，無論用上述任意一溶劑系統(tǒng)Rf值均減少；當(dāng)分子中羥基為甲基或甲氧基所取代時(shí)，Rf值增加， b.黃酮甙分子中醇羥基增多，用不同濃

15、度的乙酸展開，Rf值增加，而用正丁醇乙酸水系統(tǒng)則相反。,二、含量測(cè)定 (一)總黃酮類成分的測(cè)定 黃酮類化合物具有特定的紫外吸收帶在300400nm,帶在240 285nm，提純后可直接。 測(cè)定總黃酮時(shí)常用蘆丁作對(duì)照品。,在復(fù)方制劑中，由于其他組份吸收干擾，多需進(jìn)行顯色測(cè)定，以提高本法的選擇性和靈敏度。 與金屬鹽類試劑生成配合物，常用的是氯鹽反應(yīng)，試劑為三氯化鋁和硝酸鋁。,例:降壓丸中蘆丁的測(cè)定-鋁鹽絡(luò)合比色法 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取一定量的蘆丁液分別置于25ml量瓶中,分別加入5亞硝酸鈉1.0ml,混勻,放置6分鐘,加入10硝酸鋁1.0ml,混勻,放置6分鐘,加入4氫氧化鈉溶液10.0ml,用

16、水稀釋至刻度,混勻,放置15分鐘,在500nm處分別測(cè)定吸收度.以吸收度為縱坐標(biāo),對(duì)照品液體積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.,供試品測(cè)定 將丸劑粉碎,精密稱取相當(dāng)于1.0g槐米的細(xì)粉,置于索氏提取器中,加入60ml乙醚,回流至無色,放冷,除去乙醚,再加甲醇60ml,提取,放冷.將提取液轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中,定容.精密吸取10m1,置于另一100ml量瓶中,加水稀釋至刻度,混勻.精密吸取3.0ml于25ml量瓶中，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下“加5亞硝酸,鈉10ml”操作，測(cè)定吸收度，再從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相當(dāng)于蘆丁對(duì)照品液的體積，應(yīng)用下列算式計(jì)算蘆丁的含量。 蘆丁%=VF100%/(3W),（二）單體黃酮成分的含量

17、測(cè)定 (1)薄層色譜法 薄層色譜法是測(cè)定中藥制劑中單體黃酮類成分的關(guān)鍵是分離。樣品經(jīng)有機(jī)溶劑或水提取后，可用硅膠、纖維素或聚酰胺進(jìn)行層析，以達(dá)到分離的目的。層析后可TLC-比色法測(cè)定；也可以用薄層掃描儀直接測(cè)定。,實(shí)例 枳實(shí)導(dǎo)滯丸中橙皮甙的測(cè)定-熒光薄層掃描法 取本品適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇90ml，加熱回流4 小時(shí)，趁熱濾過至100ml 量瓶中，用少量甲醇洗滌容器，洗液與濾液合并，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取5ml ，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另橙皮苷對(duì)照品,適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml 含0.05mg的溶液，作為對(duì)照

18、品溶液。照薄層色譜法（附錄 B）試驗(yàn)，精密吸取供試品溶液5l、對(duì)照品溶液2l與5l，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇為展開劑，展開，展距約3cm ，取出，晾干，噴以 1三氯化鋁的甲醇溶液，放置3 小時(shí)，在紫外光燈(365nm) 下定位,照薄層色譜法（附錄 B薄層掃描法）進(jìn)行熒光掃描。,激發(fā)波長：330nm ,線性掃描，測(cè)量供試品熒光強(qiáng)度與對(duì)照品熒光強(qiáng)度的積分值，計(jì)算，即得。,(2)高效液相色譜法 黃酮類成分的Np-HPLC： a.無羥基的黃酮類化合物或乙?；S酮類化合物，固定相為硅膠，流動(dòng)相可套用薄層色譜條件，但極性要相對(duì)小一點(diǎn)。 b.乙?；S酮、有一個(gè)羥基的黃酮類成分，采用-CN鍵合相色譜，

19、流動(dòng)相為乙烷-氯仿。,c.含有2個(gè)以上羥基的黃酮類成分可選用-NH2鍵合相，流動(dòng)相可選用二氧六環(huán)-二氯甲烷(19)。 黃酮類成分的Rp-HPLC： 大多用C18鍵合相，流動(dòng)相常用甲醇-水-乙酸(或磷酸緩沖液)及乙腈-水。,第三節(jié) 皂甙類成分的分析,一、概述 三萜是由30個(gè)碳原子組成的萜類化合物 可看作由6個(gè)異戊二稀單元聯(lián)結(jié)而成 具有方面的藥理活性 溶于水，振搖后產(chǎn)生氣泡,人參皂苷Re (ginsenoside Re),人參皂苷Rg1 (ginsenoside Rg1),黃芪甲苷(astragaloside IV),甘草酸 (glycyrrhizic acid),二、結(jié)構(gòu)特性與理化性質(zhì) （一）結(jié)

20、構(gòu)特性 主要為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜兩大類 三萜皂苷是由三萜皂苷元和糖、糖醛酸組成 為化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，大多數(shù)無紫外吸收,（二）理化性質(zhì) 1. 物理性質(zhì) 大多數(shù)為白色或無定性粉末 2.溶解度 可溶于水，易溶于熱水、含水稀醇、熱甲醇和熱乙醇中，難溶于乙醚、苯等。,3. 顯色反應(yīng) 1醋酐-濃硫酸反應(yīng) 取含皂甙樣品置試管中，加醋酐1ml溶解后，沿試管壁加入少量濃硫酸，在兩液層中間出現(xiàn)色環(huán)，甾體皂甙生成藍(lán)色或藍(lán)黑色，而三萜皂甙則出現(xiàn)紅、粉紅或紫色。,2三氯醋酸反應(yīng) 取皂甙溶液滴在濾紙條上，滴三氯醋酸試劑,加熱到60，若斑點(diǎn)生成紅色漸變?yōu)樽仙?則樣品為甾體皂甙；若需加熱到100才出現(xiàn)以上顏色變化,則樣品

21、為三萜皂甙。 3氯仿-濃硫酸反應(yīng) 樣品溶解于氯仿,沿管壁滴加濃硫酸后,在氯仿層呈現(xiàn)紅或藍(lán)色,并有綠色熒光出現(xiàn)。,4冰醋酸-乙酰氯反應(yīng) 樣品溶于冰醋酸中，加入乙酰氯數(shù)滴及氯化鋅結(jié)晶數(shù)粒，稍加熱，則呈現(xiàn)淡紅色或紫紅色。 5五氯化銻反應(yīng) 樣品加五氯化銻的氯仿液呈紫藍(lán)色。,三、皂甙類成分的定性分析 1.泡沫反應(yīng) 取中藥材粉末約1g,加水10ml,煮沸10分鐘后過濾,將濾液于試管內(nèi)強(qiáng)烈振搖,如產(chǎn)生持久性泡沫(15分鐘以上)即為陽性反應(yīng).所產(chǎn)生的泡沫多少與pH有關(guān),取2支試管,一管加入,0.1mol/L鹽酸液5ml，另一管加入0.1 mol/L氫氧化鈉液5ml，再各加入中藥水溶液，使酸管的pH為1，堿管p

22、H為13，強(qiáng)烈振搖，如兩管所形成的泡沫高度相同，則中藥中含三萜皂甙，如堿管泡沫較酸管泡沫高數(shù)倍，則中藥中含甾體皂甙。,3.薄層色譜 進(jìn)行薄層分離時(shí)采用吸附劑常用的是硅膠或氧化鋁以及特殊需要的硅藻土。 親水性強(qiáng)的皂甙通常要求硅膠的吸附活性較弱些，展開劑的極性要大些，才能得到較好的分離效果。常用的溶劑系統(tǒng)有：氯仿-甲醇-水(1372，下層)、正丁醇-乙酸乙酯-水(415)等。,皂甙元的極性較小，如以硅膠為吸附劑，展開劑的親脂性要求強(qiáng)烈，所用的溶劑系統(tǒng)常以苯、氯仿、己烷、異丙醚等為主要組分,再加以少量其他極性溶劑。常用的溶劑系統(tǒng)有環(huán)己烷-乙酸乙酯(11)、苯-乙酸乙酯(11)、氯仿-乙酸乙酯(11)

23、等,薄層色譜后,皂甙類化合物常用的顯色劑： (1)25磷鉬酸乙醇溶液：140加熱510分鐘,皂甙元均呈深藍(lán)色,靈敏度高,不易褪色. (2)三氯化銻的濃鹽酸或氯仿溶液：90烤10分鐘,應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行,加熱后不同的皂甙元顯出不同種顏色,有助于鑒別皂甙元。 (3)硫酸-甲醇(11)：噴后加熱，顯紅褐色、紫色、黃色或黑色,與加熱溫度有關(guān)。,(4)氯磺酸-乙酸(12)溶液：噴后130加熱5分鐘，各種皂甙元顯不同顏色，如天藍(lán)、紫、粉紅、淡棕色等，在紫外光燈下也顯不同熒光，比較靈敏，可檢出10-110-3g，可用于鑒別和定量。 (5)碘蒸氣：靈敏度約為12g，碘的優(yōu)點(diǎn)是易揮發(fā)，顯色后揮去碘，斑點(diǎn)可作定量分

24、析，常用于確定斑點(diǎn)位置。,例 人參 三七 西洋參 的薄層鑒別 供試液制備: 取本品粉末1g，加氯仿40ml，置水浴回流1小時(shí)，棄氯仿液，藥渣揮干，加水飽和正丁醇10ml，超聲處理30min，取上清，加氨試液三倍量，搖勻，放置分層，取上層正丁醇液蒸干，加甲醇溶解制成1ml供試液。,對(duì)照液制備 取人參皂甙Rb1，Rb2，Rc，Re，Rd，Rg1，Rf對(duì)照品和偽人參皂甙 F11對(duì)照品，加甲醇制成每lml各含2mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。 薄層板:硅膠60預(yù)制板(Merck) 點(diǎn)樣:1l,展開劑: 氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15 40 22 10)10以下放置后的下層溶液。 展開方式 :上行展開；

25、展距：12-14cm 顯色:10%硫酸乙醇溶液，105加熱數(shù)分鐘,置紫外光燈(365nm)下檢視熒光色譜。,色譜識(shí)別 1.人參皂甙Rf為人參含有,西洋參不含,可作為人參與西洋參的區(qū)別依據(jù)之一 2西洋參含的人參皂甙Fll, 人參不含,可作為西洋參的鑒別特征； 3.生曬參與紅參之區(qū)別,在于Rgl以上的“微量皂甙”，紅參較生曬參明顯。 4.三七色譜較簡(jiǎn)單,最明顯的是Rbl, Re, Rgl三個(gè)主斑.需注意的是Re斑點(diǎn)與三七皂甙R1重疊。,樣品：1-2生曬參；3-5紅參；6-9朝鮮紅參；10-12西洋參(進(jìn)口)；13-14西洋參(國產(chǎn))；15三七；16人參皂甙對(duì)照品Rb1(S1)，Rb2(S2)，Rc

26、(S3)，Re(S4)，Rd(S5), Rg1(S6)，Rf(S7)，F(xiàn)ll(S8)。,四、皂甙類成分的定量分析 皂甙類成分的定量分析可分為 總皂苷測(cè)定 皂苷元測(cè)定 單體皂苷測(cè)定,總皂甙的含量測(cè)定一般需用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛?，如甲?8095)、乙醇等，提取后經(jīng)分離（如水飽和的正丁醇萃取，大孔吸附樹脂經(jīng)處理后溶劑洗脫）得到總皂甙成分，再根據(jù)皂甙類化合物的各自特征來選擇含量測(cè)定方法。最常用的方法是比色法。,皂甙元的含量測(cè)定時(shí)可按總皂甙的提取分離方法得到總皂甙,再加酸加熱水解,得到皂甙元,也可以將樣品先行水解,再用有機(jī)溶劑從水解后的混合液中提取皂甙元. 皂甙元含量的測(cè)定方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜

27、法和比色法。 單體皂甙的含量測(cè)定方法主要為薄層色譜法和高效液相色譜法。,(一)總皂苷的含量測(cè)定 比色法 常利用皂甙能與某些試劑反應(yīng)后產(chǎn)生顏色，然后于可見光區(qū)進(jìn)行比色測(cè)定.,常用的皂甙顯色試劑： 濃硫酸 通用試劑，反應(yīng)常顯黃色，需在較高溫度(8090)反應(yīng)3060分鐘。 高氯酸: 5的皂甙元。 硫酸-醋酐、硫酸-冰醋酸試劑:甾體皂甙。 芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸:常用的皂甙類顯色劑。 對(duì)-二甲氨基苯甲醛 : 三萜皂甙。,(二)三萜皂甙類單體成分含量測(cè)定 1.薄層色譜法 樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)娜軇┨崛。帽由V法分離定量。定量方法 可用薄層洗脫-比色法或薄層掃描法。,薄層色譜-比色法的一般步驟： 1.

28、供試品的制備:樣品的提取與預(yù)處理。 2. 對(duì)照品溶液的配制 3.薄層板的制備 4.點(diǎn)樣 對(duì)照品與供試品交叉點(diǎn)樣。,5.展開：包括預(yù)平衡與樣品展開 6.定位：日光下,紫外燈下觀察,碘蒸氣定位. 7.斑點(diǎn)捕集 8.洗脫與定量：用合適的溶劑洗脫后加顯色劑顯色，或加顯色劑顯色后離心取上清，以相同大小的固定相為空白同法操作，于合適波長處比色定量。,薄層掃描法的一般步驟： 1.供試品的制備:包括樣品的提取與預(yù)處理。 2.對(duì)照品溶液的配制 3.薄層板的制備 4.點(diǎn)樣 對(duì)照品與供試品交叉點(diǎn)樣。,5.展開：包括預(yù)平衡與樣品展開、展開方式，展開劑，展距。 6.顯色：采用合適的顯色劑噴霧顯色或衍生化顯色，與合適的溫

29、度下烤干。 7.掃描定量：在穩(wěn)定顯色的時(shí)間內(nèi)，采用薄層掃描儀選擇合適的參數(shù)掃描定量。,2.高效液相色譜法 主要用于單體皂甙和皂甙元的含量測(cè)定。具有較強(qiáng)紫外吸收的皂甙類成分可用HPLC法分離測(cè)定并用紫外檢測(cè)器，無紫外吸收或紫外吸收較弱的皂甙類成分可用HPLC法分離測(cè)定并用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。,一、概述 中藥中存在的蒽醌衍生物多為羥基蒽醌和它們的甙。 常用的含蒽醌類化合物的中藥，首推大黃，此外還有蘆薈、決明、茜草、虎杖、何首烏、番瀉葉、萱草等。,第四節(jié) 醌類成分的分析,二、結(jié)構(gòu)特征與理化性質(zhì) 具有升華性 溶于乙醚，乙醇，苯，氯仿的有機(jī)溶劑，微溶或不溶于水。 有些成分對(duì)光不穩(wěn)定 多具有酚羥基，具有一定

30、的酸性 在堿性溶液中會(huì)引起顏色改變并加深。,大黃酸,大黃酚,丹參酮 IIA,三、蒽醌類成分的定性分析 1.化學(xué)顯色反應(yīng) （1）羥基蒽醌類化合物遇堿顯紅紫紅色,（2）有-酚羥基或鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的蒽醌類化合物可與Mg2+形成橙紅、紫紅、橙黃、藍(lán)紫等顏色的絡(luò)合物。,2.升華法 游離的蒽醌及其他醌類衍生物多具有升華性。中藥制劑中如含有這類成分量較大，可采用升華法得到升華物，可見光下觀察或加堿性試液顯色定性。,3. 薄層色譜法 薄層色譜法是鑒別含蒽醌類成分的中藥制劑的最主要的定性方法。 吸附劑多用硅膠。,展開溶劑系統(tǒng)： a.大都是各種溶劑的混合系統(tǒng),大多含有水或甲醇. b.乙酸乙酯-甲醇-水(10016

31、.5135)是用途最廣的展開劑，適于分離蒽醌甙元和蒽醌甙。 c.正丙醇-乙酸乙酯-水(443)和異丙醇-乙酸乙酯-水(994)適于分離番瀉甙和二蒽酮甙。,顯色方法 噴堿性試劑或醋酸鎂甲醇液、氨氣熏 紫外燈下觀察熒光， 可見光下直接觀察色斑。,四、定量分析 （一）蒽醌類成分含量測(cè)定 1)游離蒽醌的測(cè)定 方法：稱取中藥制劑粉末適量，在索氏提取器中用氯仿回流提取至無色.氯仿提取液移入分液漏斗中,以5氫氧化鈉-2氫氧化銨混合堿液分次提取至無色,合并堿液，,用少量氯仿洗滌，氯仿棄去，堿液調(diào)整至一定體積，若不澄清，可用垂熔漏斗過濾，濾液在沸水浴中加熱4分鐘，用冷水冷卻至室溫，30分鐘后在490nm處比色，

32、以1，8-二羥基蒽醌為對(duì)照品，計(jì)算含量。,2）結(jié)合蒽醌的測(cè)定 蒽醌苷類成分極性較強(qiáng),可以用極性溶劑提取. 通常是取游離蒽醌測(cè)定項(xiàng)下的藥渣將苷提出，水解成苷元后測(cè)定； 也可將藥渣先行酸水解，然后用非極性溶劑提取苷元后測(cè)定； 或取待測(cè)樣品先行酸水解，然后用非極性溶劑提取苷元后測(cè)定，結(jié)果為總蒽醌含量，從中減去游離蒽醌含量，即為結(jié)合蒽醌含量。,3.蒽醌類單體成分的測(cè)定 一般現(xiàn)將樣品水解后測(cè)定，測(cè)定方法主要有波層掃描法和高效液相色譜法。,（二）萘醌，菲醌類成分含量測(cè)定 萘醌類見于紫草，地下明珠等制劑 菲醌類成分多見于以丹參為主藥的各類制劑中 重量法、分光光度法常用于測(cè)定萘醌、菲醌類總成分含量 色譜法、高

33、效液相色譜法常用于測(cè)定單體成分含量,第五節(jié) 揮發(fā)性成分的分析,一、概述 揮發(fā)性成分指中藥中一類具有芳香氣并易揮發(fā)的成分，化學(xué)組成復(fù)雜，主要包括揮發(fā)油類成分和其他分子量較小，易揮發(fā)的化合物。,二、結(jié)構(gòu)特征與理化性質(zhì) 可分為萜類化合物、脂肪族類化合物和芳香族類化合物 單萜、倍半萜及他們的含氧衍生物是組成揮發(fā)油的主要成分。,三、定性鑒別 （一）化學(xué)反應(yīng)法 萜類成分中含有雙鍵，能與溴，氫溴酸等起加成反應(yīng)。 不同的氧化劑在不同的條件下可以將不飽和的帖類成分氧化，常用的氧化試劑為高錳酸鉀和鉻酸 在濃硫酸存在下與香草醛反應(yīng)呈色。,（二）薄層色譜法 根據(jù)極性大小進(jìn)行分離，極性大小順序： 烴醚酯醛、酮醇、酚酸

34、常用吸附劑為硅膠、氧化鋁 常用的展開劑為石油醚或正己烷,例 避瘟散中薄荷腦、冰片的定性鑒別 主要成分：檀香,零陵香,白芷,香排草,姜黃,玫瑰花,甘松, 冰片,朱砂,薄荷腦等. 取本品0.5g,加石油醚(3060) 10ml,振搖數(shù)分鐘，濾過,濾液低溫濃縮至約2ml ,作為供試品溶液。另取薄荷腦對(duì)照品、冰片對(duì)照品，加石油醚（3060）制成每1ml 各含0.5mg 的混合溶液，,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（附錄 B）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10l ，分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以環(huán)己烷乙酸乙酯(17:3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 5香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。,（三）氣相色譜法 常用對(duì)照品對(duì)照法進(jìn)行定性鑒別，即在相同的條件下測(cè)定供試品與對(duì)照品的保留時(shí)間，以確定某組分的存在與否,四、含量測(cè)定 可分為揮發(fā)油和單一成分的測(cè)定 揮發(fā)油測(cè)定，采用揮發(fā)油測(cè)定器，用蒸餾法測(cè)定。 單一成分測(cè)定時(shí)，分離是關(guān)鍵，色譜法是揮發(fā)油類成分測(cè)定的主要方法，尤其是氣相色譜發(fā)和薄層色