1、第五章 毒物分析常用方法-免疫分析,放射免疫分析(Radio Immunoassay,RIA):是一種將同位素放射測量與免疫原理相結(jié)合的分析方法。 用于微量分析，定量測定受檢標本中的抗原,檢測限達到pg級(110-12g)。 酶標免疫分析(Enzyme -Labled Immunoassay,EIA)。 用酶標代替放射性同位素標記。無放射危害，操作方便、安全。,（一）、基本原理,放射性核素標記的抗原(radionuclide labeled antigen)和非標記抗原(unlabeled antigen)（標準抗原或被測抗原）同時與限量的特異性抗體(specific antibody)進行競

2、爭性免疫結(jié)合反應(competitive immune binding reaction)，其競爭關系可用下式表示：,一、放射免疫分析,假設受檢標本中不含抗原時的反應條件為： 4（Ag*）2（Ab）2（Ag*Ab）2（Ag*）（2）,根據(jù)標本中抗原量的不同，得到不同的反應結(jié)果。,在標本中存在抗原時，舉例如下： 4（Ag*）4（Ag）（2Ab） 1（Ag*Ab）3（Ag*）1（AgAb）3（Ag）（3）,2*Ag + 2Ag+ 2Ab *Ag + Ag + *AgAb +AgAb,*Ag與Ag的免疫活性完全相同，對Ab具有同樣的親和力，當標記抗原、非標記抗原和特異性抗體三者同時存在于一個反應系統(tǒng)

3、時,兩者相互競爭結(jié)合特異性抗體。,當*Ag和Ab為恒定量，Ag和*Ag的總量大于Ab上的有效結(jié)合點時，*Ag-Ab的形成是隨著Ag量的增加而減少，剩下來的未結(jié)合或游離的*Ag則隨著Ag量的增加而增加，稱為競爭結(jié)合反應(competitive binding reaction) 抗原抗體復合物中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈反比因此測定*Ag-Ab或*Ag的放射強度即可推出被測的Ag量。,若將抗原抗體復合物與游離標記抗原分開，分別測定其放射性強度，就可計算結(jié)合態(tài)的標記抗原（B）與游離態(tài)的標記抗原（F）的比值（B/F），結(jié)合率B/(BF)，這與標本中的抗原量呈函數(shù)關系。 用一系列不同劑量的標

4、準抗原進行反應，計算相應的B/F，可以繪制出一條劑量反應曲線。受檢標本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應曲線上查出標本中抗原的含量。,RIA標準曲線,標記用的核素有放射射線和射線兩大類。 射線主要為131I、125I、57Cr和60Co 射線有14C、3H和32P 放射性核素的選擇首先考慮比活性。 例如125I比活性的理論值是64.38104GBq/g,有較長半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g，1mol125I或14C結(jié)合到抗原上，125I的敏感度約比14C大3900倍。125I有合適的半衰期，低能量的射線易于標記，常用的RIA標記物。,1、標記物,2、標記方法 標

5、記125I的方法可分兩大類，即直接標記法和間接標記法。,直接標記法:將125I直接結(jié)合于蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基的酪氨酸上。 優(yōu)點： 操作簡便，為125I和蛋白質(zhì)的單一步驟的結(jié)合反應，它能使較多的125I結(jié)合在蛋白質(zhì)上，故標記物具有高度放射性。 只能用于標記含酪氨酸的化合物。 含酪氨酸的殘基如具有蛋白質(zhì)的特異性和生物活性，則該活性易因標記而受損傷。,間接標記法（又稱連接法）是以125I標記在載體上，純化后再與蛋白質(zhì)結(jié)合。 特點： 操作較復雜，標記蛋白質(zhì)的比放射性顯著低于直接法。 但此法可標記缺乏酪氨酸的肽類及某些蛋白質(zhì)。如直接法標記引起蛋白質(zhì)酪氨酸結(jié)構(gòu)改變而損傷其免疫及生物活性時，也可采用間接法。 它的

6、標記反應較為溫和，可以避免因蛋白質(zhì)直接加入125I液引起的生物活性的喪失。,例 氯胺T直接標記法。 氯胺T是對甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的鈉鹽，在水溶液中逐漸分解形成次氯酸，是一種氧化劑。在偏堿溶液中（pH7.5），氯胺T將125I的I氧化為I+，I+取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形成二碘酪氨酸。反應式：,含有特異性抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑，常以抗原免疫小動物誘發(fā)產(chǎn)生多克隆抗體而得。 抗血清的質(zhì)量直接影響分析的靈敏度和特異性。 抗血清質(zhì)量的指標主要有親和常數(shù)、交叉反應率和滴度。,3、抗血清的檢定,（1）親和常數(shù) 親和常數(shù)（affinityconstant）常用K值表示。它反映抗體與相應

7、抗原的結(jié)合能力。 抗血清K值越大，放射免疫分析的靈敏度、精密和準確度越佳。,（2）交叉反應率 放射免疫分析測定的物質(zhì)有些具有極為類似的結(jié)構(gòu)，針對一種抗原的抗血清往往對于其類似物會發(fā)生交叉反應。 例如甲狀腺素的T3、T4，雌激素中的雌二醇、雌三醇等。 因此交叉反應率反映抗血清的特異性，交叉反應率過大將影響分析方法的準確性。,（3）滴度 滴度系指將血清稀釋時能與抗原發(fā)生反應的最高稀釋度。 反映抗血清中有效抗體的濃度。 在放射免疫分析中滴度為在無受檢抗原存在時，結(jié)合50標記抗原時抗血清的稀釋度。,（二）、測定方法,放射免疫分析三個步驟： 抗原抗體的競爭抑制反應 B和F的分離 放射性的測量。,1、抗原

8、抗體反應 將抗原（標準品和受檢標本）、標記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定的溫度下進行反應一定時間，使競爭抑制反應達到平衡。 不同質(zhì)量的抗體和不同含量的抗原對溫育的溫度和時間有不同的要求。,受檢標本抗原含量高，抗血清的親和常數(shù)較大:可選擇較高的溫度（1537）,短時間的溫育 抗原抗體復合物較為牢固。,2、B、F分離技術 在RIA反應中，標記抗原和特異性抗體的含量極微，形成的標記抗原抗體復合物（B）不能自行沉淀，需加入合適的沉淀劑或吸附劑使它徹底沉淀，以完成與游離標記抗原（F）的分離。,（1）聚乙二醇（PEG）沉淀法 PEG沉淀劑的主要優(yōu)點是制備方便，沉淀完全。缺點是非特異性結(jié)合率比用

9、第二抗體為高，且溫度高于30時沉淀物容易復溶。,（2）活性炭吸附法 小分子游離抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子復合物留在溶液中。 例：在活性炭表面涂上一層葡聚糖，使它表面具有一定孔徑的網(wǎng)眼，在抗原與特異性抗體反應后，加入葡聚糖活性炭。放置510min，使游離抗原吸附在活性炭顆粒上，離心使顆粒沉淀，上清液中含有結(jié)合的標記抗原。,3、放射性強度的測定 B、F分離后，即可進行放射性強度測定。,測量儀器 液體閃爍計數(shù)儀 晶體閃爍計數(shù)儀,每次測定均需作標準曲線圖 以標準抗原的不同濃度為橫坐標，以在測定中得到的相應放射性強度為縱坐標作圖，放射性強度可任選B或F，亦可用計算值B/(BF)、B/F和B/B0。

10、 標本應作雙份測定，取其平均值，在制作的標準曲線圖上查出相應的受檢抗原濃度。,系列試管中加入規(guī)定量*Ag、Ab 再依次加入已知不等量Ag 培育后分離Agf 與AgAb 測定放射活性 以B/F或F/B作縱座標，對Agt作圖 樣品同法操作，據(jù)此可測定未知Ag濃度,總結(jié)：免疫法測定步驟,二、酶聯(lián)免疫法（ ELISA ） (enzyme linked immunosorbant assay),（一）、基本原理,酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種固相免疫測定技術，其先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。測定時，將待檢樣本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應，后加入酶標抗

11、體與免疫復合物結(jié)合，用洗滌的方法分離抗原抗體復合物和游離的未結(jié)合成分，最后加入酶反應底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)值的大小進行定性或定量分析的方法。,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。 測定方法中3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體 酶標記的抗原或抗體 酶作用的底物。,根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。,雙抗體夾心法 間接法測抗體 競爭法,（二）、酶聯(lián)免疫法的類型,1、雙抗體夾心法 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法 將已知抗體吸附于固相載體, 加入待檢標本(含相應抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標抗體和底物進行測定。,操

12、作步驟： 用已知特異性抗體包被固相載體 加待檢標本，經(jīng)過溫育使相應抗原與固相抗體結(jié)合；洗滌，除去無關的物質(zhì) 加酶標特異性抗體，與已結(jié)合在固相抗體上的抗原反應；洗滌，除去未結(jié)合的酶標抗體 加底物顯色，終止反應后，目測定性或用酶標儀測量光密度值進行定量測定。,2、間接法 此法是測定抗體最常用的方法 將已知抗原吸附于固相載體，加人待檢標本(含相應抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加人酶標抗球蛋白抗體(酶標抗抗體)和底物進行測定。,操作步驟： 包被固相載體: 用已知抗原包被固相載體 加待檢標本: 經(jīng)過溫育(372h)，使相應抗體與固相抗原結(jié)合。洗滌，除去無關的物質(zhì)； 加酶標抗抗體: 再次溫育(372h)與固相載體上抗原抗體復合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標抗抗體 加底物顯色: 終止反應后，目測定性或用酶標儀測光密度值定量測定。,3、竟爭法 此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。 以測定抗原為例, 將特異性抗體吸附于固相載體；加入待測抗原和一定量的酶標已知抗原，使二者競爭與固相抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關。,操作步驟： 用已知特異性抗體包被固相載體； 測定管加待測抗原和一定量的酶標抗原，溫育，使二者與固相抗體競爭結(jié)合；對照管只加一