1、細(xì)胞因子的檢測,第一節(jié) 細(xì)胞因子檢測概述,一、細(xì)胞因子的類型與作用特點 二、細(xì)胞因子檢測的特點與方法,由非神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的一大類與免疫應(yīng)答活動密切相關(guān)的低分子蛋白與多肽。,細(xì)胞因子,細(xì)胞因子的類型與作用特點,1、細(xì)胞因子的分類 2、細(xì)胞因子的作用特點,以生物學(xué)作用進(jìn)行劃分的分類,白細(xì)胞介素（Interleukin） IL-1、IL-2、 IL-18 干擾素（Interferon） IFN-、IFN-、IFN- 腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor） TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor） M-CSF、G-CSF 轉(zhuǎn)化生

2、長因子（Transforming growth factor） TGF- 趨化因子（Chemokine） IL-8、GROs、MCP-1 生長因子（Growth factor） EGF、FGF、IGF、PDGF,TNFs,ILs,IFNs,TGFs,Chemokines,CSFs,各類細(xì)胞因子間關(guān)系,1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性 2、多源與同源性 3、高效性 4、多效性（pleiotropy） 5、豐余性（redundancy） 6、協(xié)同性 7、拮抗性 8、網(wǎng)絡(luò)性,細(xì)胞因子,細(xì)胞因子,細(xì)胞因子受體,細(xì)胞因子受體,細(xì)胞因子的自分泌與旁分泌性,I L-2 I F

3、N- TNF-,細(xì)胞因子的同源性與多源性,I FN-,T細(xì)胞,T細(xì)胞,NK細(xì)胞,IL-4,肥大細(xì)胞,Th細(xì)胞,細(xì)胞因子的多效性,細(xì)胞因子的豐余性,IL-2 IL-4 IL-5,細(xì)胞因子的協(xié)同性,IL-4 IL-5,細(xì)胞因子的拮抗性,IL-4,I FN-,細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)性,IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、 GM-CSF,TNF TGF IL-1 IFN,IL-1 IFN,TNFIL-1 TGF,IFNIL2 IL-4,IFN IL2 IL-4 IL-5 IL-6,TNF IFN IL-1 TGF,TNF IL-1 IFN IL-5 GM-CSF G-CSF M-GSF,TNF,TNF I

4、L-1 TGF,IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF,IL-1 IL-6,IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IFN,內(nèi)皮細(xì)胞,成纖維細(xì)胞,T,B,細(xì)胞因子檢測的特點與方法,1、檢測的特點 2、檢測的方法,細(xì)胞因子檢測的特點,免疫原性較弱 樣品含量低 樣品具有時效性 生物效應(yīng)特異性差,細(xì)胞因子檢測的方法,免疫學(xué)檢測方法抗原性檢測 細(xì)胞生物學(xué)檢測方法生物活性檢測 分子生物學(xué)檢測方法基因表達(dá)檢測,第二節(jié) 細(xì)胞因子檢測的方法與原理,一、細(xì)胞因子的細(xì)胞生物學(xué)檢測 二、細(xì)胞因子的免疫學(xué)檢測 三、細(xì)胞因子的分子生物學(xué)檢測,細(xì)胞因子的細(xì)胞生物學(xué)檢測,1、檢測方法與原

5、理 2、檢測中的操作注意要點,檢測方法與原理,細(xì)胞增殖或增殖抑制試驗 細(xì)胞病變抑制試驗 細(xì)胞毒試驗 細(xì)胞趨化試驗,濾膜：計數(shù)受趨化細(xì)胞,趨化因子,細(xì)胞,趨化試驗原理示意,檢測中的操作注意要點,靶細(xì)胞的選擇與培養(yǎng) 檢測標(biāo)本的制備 顯示檢測結(jié)果,靶細(xì)胞的選擇與培養(yǎng),1、對所測的細(xì)胞因子有特異的敏感性 2、易培養(yǎng)、保存、生物學(xué)特性穩(wěn)定 3、有良好的生長狀態(tài) 4、種屬適配,各類細(xì)胞因子檢測的常用靶細(xì)胞,細(xì)胞因子 實驗系統(tǒng) 干擾因素 IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法 IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4 IL-3 KG-1（H

6、）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPO IL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2 IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4,各類細(xì)胞因子檢測的常用靶細(xì)胞,細(xì)胞因子 實驗系統(tǒng) 干擾因素 IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性粒細(xì)胞（M、H）趨化法 GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5 TNF/ L929 （M、H）細(xì)胞毒法 IFN wish（H）病變保護(hù)法 IFN- 、 IFN- L929（M）病變保護(hù)法 IFN- 、 IFN-

7、 ,檢測標(biāo)本的準(zhǔn)備,1、分離特定的產(chǎn)生細(xì)胞 2、對產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)、激活 3、選擇適當(dāng)?shù)氖占瘯r間,顯示檢測結(jié)果,1、細(xì)胞增殖狀態(tài)的顯示： 放射性核素?fù)饺敕ā?胞內(nèi)酶活性顯示法 活細(xì)胞染色法 細(xì)胞熒光測定法 2、細(xì)胞毒或細(xì)胞病變狀態(tài)的顯示 活細(xì)胞染色法 胞內(nèi)酶活性顯示法 DNA斷片測定法,細(xì)胞因子的免疫學(xué)檢測,分泌型細(xì)胞因子的檢測 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測,ELISPOT,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測技術(shù),激活,膜抗原標(biāo)記,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記,細(xì)胞因子的分子生物學(xué)檢測,原位雜交技術(shù) Rt-PCR技術(shù),第三節(jié) 常用細(xì)胞因子的檢測方法,一、IL-2的檢測 二、IFN-的檢測 三、TNF的檢測,待檢樣品（細(xì)胞上清）

8、 指示細(xì)胞（CTLL-2）,按不同稀釋度加入,37C，16-20小時,加入3HTdR（1-5Ci）,37C，4-6小時,收集細(xì)胞,測定,白細(xì)胞介素-2的測定示意圖,待檢樣品（細(xì)胞上清） 指示細(xì)胞（L929）,按不同稀釋度加入,37C，4小時,37C，24-48小時,棄取上清，加入VSV,觀察細(xì)胞病變（鏡檢或比色）,干擾素的測定示意圖,腫瘤壞死因子的測定示意圖,待檢樣品（細(xì)胞上清） 指示細(xì)胞（L929）,按不同稀釋度加入,37C，24小時,棄取上清，洗滌,加入結(jié)晶紫染液，洗滌,加入細(xì)胞裂解液，比色,第四節(jié) 細(xì)胞因子受體的檢測,一、細(xì)胞因子受體的類型 二、細(xì)胞因子受體的檢測,細(xì)胞因子受體的類型,膜型細(xì)胞因子受體 分泌