1、第二章 發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離,目的,不僅在于分離細胞、菌體和其它懸浮顆粒（細胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物）， 還希望除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于后繼各步操作。,采用絮凝或凝聚的方法，設(shè)法增大懸浮液中固體粒子的大小，提高其沉降速度； 或采用稀釋、加熱等方法降低黏度，以利于過濾。,第一節(jié) 發(fā)酵液的預(yù)處理,一、發(fā)酵液過濾特性的改變,微生物發(fā)酵液的成分極為復(fù)雜，其中除了所培養(yǎng)的微生物菌體及殘存的固體培養(yǎng)基外，還有未被微生物完全利用的糖類、無機鹽、蛋白質(zhì)，以及微生物的各種代謝產(chǎn)物。,微生物發(fā)酵液的特性為： 發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1-10%，懸浮液中大部分是水； 懸浮物顆粒小，相對密度

2、與液相相差不大； 固體粒子可壓縮性大； 液相粘度大，大多為非牛頓型流體； 性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。,改善發(fā)酵液過濾特性的物理化學(xué)方法： 調(diào)酸（等電點）、熱處理、電解質(zhì)處理、添加凝聚劑、添加表面活性物質(zhì)、添加反應(yīng)劑、冷凍-解凍及添加助濾劑等。,1、降低液體粘度 （1）加水稀釋法 加水稀釋法能降低液體粘度，但會增加懸浮液的體積，加大后繼過程的處理任務(wù)。而且，單從過濾操作看，稀釋后過濾速率提高的百分比必須大于加水比才能認為有效，即若加水一倍，則稀釋后液體的粘度必須下降50以上才能有效提高過濾速率。,（2）升高溫度 加熱是發(fā)酵液預(yù)處理最簡單最常用的方

3、法。加熱可有效降低液體粘度，提高過濾速率。同時，在適當溫度和受熱時間下可使蛋白質(zhì)凝聚，形成較大顆粒的凝聚物，進一步改善了發(fā)酵液的過濾特性。,對于粘度較高的發(fā)酵液，稀釋或者加熱可以降低發(fā)酵液黏度，有利于輸送和過濾等后續(xù)操作。史鵬等的研究比較了熱處理和酸處理兩種方法對HA 分子量降低的影響。 注意加熱溫度與時間，不影響產(chǎn)物活性和細胞的完整性。 溫度過高或時間過長，會使細胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，增加發(fā)酵液的復(fù)雜性，影響其后的產(chǎn)物分離與純化。,2.調(diào)整pH,通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染；細胞、細胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進

4、行。,凝聚指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象； 絮凝指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團的過程。,3、凝聚與絮凝,陽離子對帶負電荷的膠粒凝聚能力的次序為：,Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+,常用的凝聚劑電解質(zhì)有：,硫酸鋁 Al2(SO4)318H2O（明礬）； 氯化鋁 AlCl36H2O; 三氯化鐵 FeCl3; 硫酸亞鐵 FeSO47H2O ； 石灰；ZnSO4；MgCO3,（1）凝聚 發(fā)酵液中的細胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子雙電層的結(jié)構(gòu)使膠粒之間不易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)。,采用

5、絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分離。 絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團，包括帶電荷的陰離子（如-COOH）或陽離子（如-NH2）基團以及不帶電荷的非離子型基團。 它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。 當一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)結(jié)時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。,（2）絮凝,1）有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物； 2）無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等； 3）天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸

6、鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。,工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：,目前最常見的高分子聚合物絮凝劑,有機合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）類衍生物,根據(jù)活性基團在水中解離情況不同，可分為三類： 非離子型 陰離子型（含有羧基） 陽離子型（含有胺基）,聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點,用量少，一般以mg/L計量； 絮凝體粗大，分離效果好； 絮凝速度快； 種類多，適用范圍廣。,聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點,存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)謹慎。,聚丙烯酰胺類絮凝劑的應(yīng)用,醫(yī)藥和食品工業(yè)：聚丙烯酸類陰離子絮凝劑（無毒），聚苯乙烯類衍生物，無機高分子聚合物絮凝劑（

7、聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等），天然有機高分子絮凝劑（多聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等）。,對于帶負電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機理； 對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。,（3）混凝,4.加入助濾劑,一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。懸浮液中大量的細微膠體粒子被吸附到助濾劑的表面上，改變了濾餅結(jié)構(gòu)，降低了過濾阻力。 常用的助濾劑有： 硅藻土、纖維素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。 使用硅藻土?xí)r，

8、通常細粒用量為500 g/m3；中等粒度用量為700 g/m3；粗粒用量為700-1000 g/m3。,5.加入反應(yīng)劑,加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固，改善過濾性能；如發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速率。 如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過濾效率5倍。,發(fā)酵液中的雜質(zhì),高價無機離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+） 雜蛋白,在采用離子交換提煉時，會

9、影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。,在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力， 在有機溶劑法或雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清。 在常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾效率。,因此，在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。,二、發(fā)酵液的相對純化,（一）高價無機離子的去除方法,Ca2+ 草酸、草酸鈉，形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸） ； Mg2+三聚磷酸鈉，形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物； Fe2+ 黃血鹽，普魯士蘭沉淀,（二）雜蛋白的去除方法,蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。 在酸性溶液中帶正電荷； 在堿性溶液中帶負電荷。 在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，

10、稱為等電點。,1. 沉淀法,在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀； 在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子，如Ag+、Cu+、Zn+、Fe+和Pb+等形成沉淀。,酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與鹽或離子形成沉淀。,2. 變性法,加熱； 大幅度調(diào)節(jié)pH值； 加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。,不足之處,加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物； 極端pH值也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿； 有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。,加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。 在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵

11、氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)； 在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。,3. 吸附法,第二節(jié) 固液分離工程及設(shè)備,重力沉降 浮選 旋液分離 介質(zhì)過濾 離心,通氣，產(chǎn)生氣泡，使固體附著在氣泡表面除去。 用于固液比重差小、直徑530m顆粒的分離，污水處理,懸浮液以較高速度沿切線方向進入旋風(fēng)分離器， 輕相由分離器中央排出， 重相由分離器下部排出， 但不適合直徑5 m顆粒去除（可用絲網(wǎng)分離器）。,工業(yè)上常用,霉菌和放線菌為絲狀菌，體形較大，發(fā)酵液采用過濾方法； 細菌和酵母菌為單細胞，體形較小，其發(fā)酵液采用高速離心分離，如對

12、發(fā)酵液進行預(yù)處理，也可用過濾進行固液分離。,一、固液分離的方法,優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好； 缺點：設(shè)備投資高、能耗大。 離心機種類：碟片式離心機 管式離心機 傾析式離心機,1. 離心分離,在液相非均一系統(tǒng)中，利用離心力達到液液、液固、液液固分離的方法，統(tǒng)稱為離心分離。,離心分離因數(shù),重量kg,旋轉(zhuǎn)直徑,轉(zhuǎn)速r/min,微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細胞或細胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。,過濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進行分離的過程。 在過濾操作中，要求濾速快、濾液澄清，并且有高的收率。,2. 過濾,A. 根據(jù)過濾機理，過濾操作可分為澄清過濾和濾餅過濾,澄清過濾,過濾

13、介質(zhì)為硅藻土、砂、顆粒活性炭、玻璃珠、 塑料顆粒等 適合于固體含量少于0.1g/100ml、顆粒直徑在5- 100um的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。,濾餅過濾,過濾介質(zhì)為濾布 包括天然或合成纖維織布、金屬織布、玻璃纖維紙、 合成纖維等無紡布。 適合于固體含量大于0.1g/100ml的懸浮液的過濾分離。 按推動力不同分四種：重力過濾，加壓過濾，真空過濾，離心過濾。,菌種：真菌，放線菌，細菌 培養(yǎng)基：黃豆，花生，淀粉，后期加油，培養(yǎng)基未用完 發(fā)酵時間：菌絲自溶前放罐 黏度（發(fā)酵液）,影響過濾的因素,B. 常用過濾設(shè)備,（1）板框壓濾機,廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。,（2）真空轉(zhuǎn)鼓過濾機,1）切向流過濾（Cross-Flow Filtration）又稱錯流過濾 交叉過濾和十字流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術(shù)。其操作特點是使懸浮液在過濾介質(zhì)表面作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走。,3. 其他固液分離方法,2）雙水相萃取 向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，