1、微生物的代謝調(diào)節(jié)和代謝工程,微生物的生長過程中機體內(nèi)的復(fù)雜代謝過程是相互協(xié)調(diào)和高度有序的，并對外環(huán)境的改變能迅速作出適應(yīng)反應(yīng)。 我們的目的：讓微生物建立新的代謝方式，高濃度的積累人們所期望的產(chǎn)品。,代謝調(diào)節(jié) 代謝工程,代謝調(diào)節(jié),1、微生物的代謝類型和自我調(diào)節(jié) 2、酶活性調(diào)節(jié) 3、酶合成調(diào)節(jié) 4、分支生物合成途徑調(diào)節(jié) 5、能荷調(diào)節(jié) 6、代謝調(diào)控（人為） 7、次級代謝與次級代謝調(diào)節(jié),微生物的自我調(diào)節(jié),微生物體內(nèi)物質(zhì)的合成和降解是由其自我調(diào)控的。 在單一有機化合物碳源的培養(yǎng)基中，大分子合成途徑中各個環(huán)節(jié)配合的很好，效率高。 存在多種不同的碳源時，細胞會優(yōu)先吸收某一碳源，在體內(nèi)合成大量與代謝相關(guān)的酶類

2、。,分解途徑,合成代謝,葡萄糖合成,培養(yǎng)基中葡萄糖,培養(yǎng)基中甘露糖,抑制？ 阻遏？,自我調(diào)節(jié)的部位,膜系統(tǒng)的選擇性吸收。 核內(nèi)相關(guān)基因的調(diào)控表達。 酶系在細胞基質(zhì)內(nèi)被分隔。,酶活性的調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)的是已有酶的活性，是在酶化學(xué)水平上發(fā)生的調(diào)節(jié)。 包括酶活性的激活和抑制兩個方面。,酶合成的調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)的是酶分子的合成量，是在遺傳水平上發(fā)生的調(diào)節(jié) 包括酶合成的誘導(dǎo)和阻遏,二種水平上的重要的兩種方式：反饋抑制和反饋阻遏,酶活性調(diào)節(jié),酶的激活作用 酶的抑制作用,酶活性的調(diào)節(jié)機制別構(gòu)調(diào)節(jié)（變構(gòu)調(diào)節(jié)）,別構(gòu)效應(yīng) ：底物或底物以外的物質(zhì)和別構(gòu)酶分子上的相應(yīng)部位可逆地非共價結(jié)合后，通過酶分子構(gòu)象的變化影響酶的催化活性

3、，這種效應(yīng)稱為別構(gòu)效應(yīng) 別構(gòu)效應(yīng)劑 ：引起別構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)稱為效應(yīng)物 別構(gòu)激活劑：凡是和酶分子結(jié)合后使酶反應(yīng)速度加快的別構(gòu)效應(yīng)劑就稱為別構(gòu)激活劑（正效應(yīng)劑） 別構(gòu)抑制劑：（負效應(yīng)劑）,別構(gòu)酶：具有別構(gòu)效應(yīng)的酶稱之為別構(gòu)酶 別構(gòu)酶通常能對反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用，是調(diào)節(jié)酶的一種。,別構(gòu)酶舉例大腸桿菌（E. coli）天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（簡稱ATCase）,ATCase有二個底物和CTP、ATP二個別構(gòu)效應(yīng)劑Asp、ATP是別構(gòu)激活劑，CTP是別構(gòu)抑制劑,ATCase（天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶）,ATCase的相對分子質(zhì)量是310 000，由12條多肽鏈組成 每個調(diào)節(jié)亞基上有兩個別構(gòu)效應(yīng)劑（CTP、ATP）的結(jié)合部

4、位,完整有活性的酶,催化亞基（三聚體）,調(diào)節(jié)亞基（二聚體）,酶合成的調(diào)節(jié),誘導(dǎo)和阻遏 誘導(dǎo)：某種化合物作用下，導(dǎo)致某種酶合成或合成速率提高的現(xiàn)象。 阻遏：某種化合物作用下，導(dǎo)致某種酶合成停止或合成速率降低的現(xiàn)象。,酶合成的誘導(dǎo)作用,組成酶：不依賴于酶底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在二合成的酶。 誘導(dǎo)酶：依賴于某種底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。,酶合成的阻遏,酶合成的阻遏：在微生物代謝中，胞內(nèi)某種產(chǎn)物的積累造成該產(chǎn)物合成途徑中前面某種酶的合成受到阻礙。 末端產(chǎn)物阻遏：如果代謝產(chǎn)物是合成途徑的終產(chǎn)物，則為末端產(chǎn)物阻遏。 分解代謝產(chǎn)物阻遏：如果代謝產(chǎn)物是某種化合物分解的中間產(chǎn)物，則為分解代謝產(chǎn)

5、物阻遏。 葡萄糖效應(yīng),酶合成的機制,乳糖操縱子模型 誘導(dǎo)和阻遏,分支生物合成途徑的調(diào)節(jié),同工酶調(diào)節(jié) 協(xié)同反饋抑制 增效（合作）反饋抑制 累積反饋抑制 順序反饋抑制 聯(lián)合激活或抑制調(diào)節(jié) 酶的共價修飾,AK：天冬氨酸激酶； HSDH：天冬氨酸脫氫酶,分支生物合成途徑的調(diào)節(jié),同工酶：E. coli 天冬氨酸族氨基酸合成，天冬氨酸激酶I、II、III。 協(xié)同反饋調(diào)節(jié)：一種酶受到反饋調(diào)節(jié)，但需要一種以上終產(chǎn)物過量 累加反饋調(diào)節(jié)：多個末端產(chǎn)物抑制第一個酶，單獨只能部分抑制或阻遏，總的效果是累加的 增效反饋調(diào)節(jié)：多個末端產(chǎn)物抑制第一個酶，多個末端產(chǎn)物抑制第一個酶，單獨只能部分抑制或阻遏，總的效果是增效的,分

6、支生物合成途徑的調(diào)節(jié),順序反饋調(diào)節(jié)：依次反饋調(diào)節(jié) 聯(lián)合激活或抑制調(diào)節(jié)：一種生物合成的中間產(chǎn)物參與兩個完全獨立的、不交叉的合成途徑的控制。這種中間體物質(zhì)濃度的變化會影響這兩個獨立代謝途徑的代謝效率。 如：腸細菌氨甲酰磷酸合成酶的聯(lián)合激活和抑制調(diào)節(jié),分支生物合成途徑的調(diào)節(jié),酶的共價修飾 大腸桿菌谷胺酰胺合成酶 由于共價修飾引起活力的改變 有無腺苷?；?中間產(chǎn)物,U,V,W,末端產(chǎn)物,t,u,v,w,反饋抑制,末端產(chǎn)物直線式抑制,A,B,C,D,E,F,G,H,a,b,c,同工酶調(diào)節(jié),能荷代謝,能荷：細胞中ATP、ADP、AMP系統(tǒng)中可為代謝反應(yīng)功能的高能磷酸鍵的量度。 表示式：P64（35） 大腸

7、桿菌的能荷在生長期間為0.8，靜止期為0.5。,代謝調(diào)控,在人為條件的控制下，可以使微生物過量產(chǎn)生各級初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物。 一般可以根據(jù)代謝調(diào)節(jié)理論，通過改變發(fā)酵工藝條件如pH、溫度、通氣量、培養(yǎng)基的組成和微生物遺傳特性等，達到改變菌體內(nèi)的代 謝平衡，過量產(chǎn)生所需要產(chǎn)物的目的。,代謝調(diào)控 發(fā)酵條件的控制 改變細胞的透性 菌種遺傳特性的改變,在生產(chǎn)中，如果發(fā)酵的條件不同，可能生成的主要產(chǎn)物也不同。 控制不同的發(fā)酵條件，影響微生物的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使其體內(nèi)代謝按人們設(shè)想的方向進行。,(一）發(fā)酵條件的控制,1. 以谷氨酸生產(chǎn)工藝為例 各種發(fā)酵條件改變的影響,工業(yè)化生產(chǎn)開始于由水解小麥面筋或大豆

8、蛋白質(zhì)而制取。 1957年，日本率先采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，并投入大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，這是被譽為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，使發(fā)酵工業(yè)進入調(diào)節(jié)代謝的調(diào)控階段。,產(chǎn)生菌株特點： 革蘭氏陽性 不形成芽胞 沒有鞭毛，不能運動 需要生物素作為生長因子 在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。,谷氨酸生物合成機理： 由三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶和氫供體存在下進行還原性氨化作用而得到。,Production Process of L-Glutamic acid,Sketch of main reaction in Corynebacterium glutamicum Connected with the c

9、itric acid cycly,不通發(fā)酵條件對谷氨酸產(chǎn)生菌代謝方向的影響,發(fā)酵條件 代謝方向,通氣 乳酸或琥珀酸 谷氨酸 NH4+ a-酮戊二酸 谷氨酸 谷氨酰胺 生物素 乳酸或琥珀酸 谷氨酸,適量,適量,適量,不足,不足,不足,不足,適量,2添加生物合成的前體,合成途徑中增加其中一個前體的量，可以大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)量。,前體：某些化合物在加入培養(yǎng)基后，能夠直接在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而自身的結(jié)構(gòu)并未發(fā)生太大變化，這類小分子物質(zhì)稱為前體。,PEP,色氨酸合成途徑,鄰氨基苯甲酸,色氨酸,鄰氨基苯甲酸,反饋抑制,3-脫氧-2-酮-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-P,4-P-赤蘚糖,3、其他條件

10、的控制 使用誘導(dǎo)物- 生產(chǎn)相關(guān)酶類時，可以加入相應(yīng)的底物作為誘導(dǎo)物，可以有效增加這些酶的產(chǎn)量。 培養(yǎng)基成分和濃度的控制- 盡量避免由于培養(yǎng)基的不當(dāng)使用引起的分解代謝阻遏。在發(fā)酵培養(yǎng)基中通常采用適量的速效和遲效碳源、氮源的配比。,（二）改變細胞透性,發(fā)酵過程中，可以控制使用那些影響細胞膜通透性的物質(zhì)作為培養(yǎng)基的成分，有利于代謝產(chǎn)物分泌出來，從而避免了末端產(chǎn)物的反饋抑制調(diào)節(jié)。,1. 通過生理學(xué)手段控制細胞膜滲透性,2. 通過細胞膜缺損突變控制細胞膜滲透性,（三）菌種遺傳特性的改變,改變微生物的遺傳特性，即改變酶的活性或酶的合成系統(tǒng)，使之對反饋調(diào)節(jié)不敏感，達到過量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的目的。 用于這樣生產(chǎn)的

11、菌株多為抗反饋調(diào)節(jié)突變株和營養(yǎng)缺陷型菌株。,應(yīng)用抗反饋調(diào)節(jié)突變株解除反饋調(diào)節(jié),抗反饋調(diào)節(jié)突變株：對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐曰蚣娑兄木辍?反饋抑制或阻遏或兩者解除。,分解途徑,合成代謝,蘇氨酸合成,培養(yǎng)基中蘇氨酸類似物,抑制或阻遏解除,利用營養(yǎng)缺陷型突變株生產(chǎn)的氨基酸,產(chǎn)物 菌株 營養(yǎng)缺陷型 基質(zhì) 效價（g/L）,L-瓜氨酸 枯草桿菌 精氨酸 葡萄糖 16 L-賴氨酸 谷氨酸棒狀桿菌 蘇氨酸，蛋氨酸 葡萄糖 50 L-尿氨酸 谷氨酸棒狀桿菌 精氨酸 葡萄糖 25 L-苯丙氨酸 石蠟棒狀桿菌 酪氨酸 正烷烴 15 L-蘇氨酸 大腸桿菌 Lys, Met, ILe 葡萄糖 20,工業(yè)上利用

12、抗反饋調(diào)節(jié)突變株生產(chǎn)的氨基酸,產(chǎn)物 菌株 所抗結(jié)構(gòu)類似物,L-精氨酸 谷氨酸棒狀桿菌 D-精氨酸 L-組氨酸 谷氨酸棒狀桿菌 三唑丙氨酸 L-異亮氨酸 短桿菌 -氨基-羥基戊酸 L-蘇氨酸 短桿菌 -氨基-羥基戊酸,次級代謝與次級代謝調(diào)節(jié),初級代謝和次級代謝 次級代謝的調(diào)節(jié)類型,（一）初級代謝和次級代謝 初級代謝：普遍存在于生物中的代謝類型，微生物從外界吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)，通過分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動所必需的物質(zhì)和能量的過程，稱為初級代謝。 。 初級代謝產(chǎn)物：單糖、核苷酸、脂肪酸等單體，以及由他們組成的各種大分子聚合物如蛋白質(zhì)、核酸等，是有機體生存必不可少的物質(zhì)。,次級代謝：某些微生

13、物為了避免代謝過程中，某種代謝產(chǎn)物的積累造成的不利作用，而產(chǎn)生的一類有利于生存的代謝類型。 次級代謝產(chǎn)物：在次級代謝途徑中合成的產(chǎn)物，不是微生物生長所必需的，種類很多，如氨基糖衍生物等。,次級代謝不同于初級代謝。初級代謝自始至終貫穿于細胞的生活周期中，對外界環(huán)境變化敏感性小，其合成酶專一性強。 而次級代謝僅在細胞體生長的某個階段產(chǎn)生，對外界環(huán)境變化敏感，合成酶專一性不強。,現(xiàn)代抗生素的定義: 由某些微生物產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì),能抑制微生物和其他細胞增殖的物質(zhì)叫做抗生素。,（二）次級代謝的調(diào)節(jié)類型 總體類型包括： 酶的合成誘導(dǎo)和阻遏 酶活性的激活和抑制 細分類型包括：氮分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)、碳分解 產(chǎn)物調(diào)節(jié)和

14、磷酸鹽調(diào)節(jié)等等。,反饋調(diào)節(jié) 1、次級代謝產(chǎn)物的自身反饋調(diào)節(jié)，包括反饋抑制和反饋阻遏。,2、分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié) 碳的分解產(chǎn)物和氮的分解產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)作用存在于次級代謝中。 如葡萄糖抑制發(fā)酵中青霉素、春日霉素、吲哚霉素、放線菌素等抗生素的合成。 鏈霉素產(chǎn)生菌培養(yǎng)中，銨鹽作唯一氮源時，可對鏈霉素合成產(chǎn)生抑制作用。,3、初級代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié) 3.1 初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物的合成之間有一條共同的合成途徑，當(dāng)初級代謝產(chǎn)物積累時，反饋抑制了某一步反應(yīng)的進行，而最終抑制了次級代謝產(chǎn)物的合成。, - 酮戊二酸,青霉素合成途徑調(diào)節(jié),高檸檬酸合成酶,-腺苷酸-氨基己二酸, - o氨基己二酸,反饋抑制,高檸檬酸,乙酰C

15、oA,青霉素G,-（-氨基己二酸酰） -L-半胱氨酸,賴氨酸,反饋阻遏,3.2初級代謝產(chǎn)物直接參與次級代謝產(chǎn)物的生物合成，當(dāng)初級代謝產(chǎn)物積累，反饋抑制自身的合成，同時也影響了次級代謝產(chǎn)物的合成。,4磷酸鹽的調(diào)節(jié),磷酸鹽不僅是菌體生長的主要限制性營養(yǎng)成分，還是調(diào)節(jié)抗生素生物合成的重要參數(shù)。其機制按效應(yīng)劑說有直接作用，即磷酸鹽自身影響抗生素合成，可能通過抑制相關(guān)酶的活性。間接作用，即磷酸鹽調(diào)節(jié)胞內(nèi)其他效應(yīng)劑(如ATP、腺苷酸能量負荷和cAMP)，進而影響抗生素合成。 已發(fā)現(xiàn)過量磷酸鹽對四環(huán)素、氨基糖苷類和多烯大環(huán)內(nèi)酯等32種抗生素的合成產(chǎn)生阻抑作用。,利用基因工程技術(shù)，定向改造細胞代謝途徑，并與基

16、因調(diào)控、代謝調(diào)控相結(jié)合，構(gòu)建新的代謝途徑 包括三種代謝工程設(shè)計方法： 改變代謝途徑 擴展代謝途徑 構(gòu)建新的代謝途徑,代謝工程概述,A,C,B,D,F,加速,代謝旁路,缺失,E,擴展途徑,G,新途徑,H,三種方法的簡易圖示,（一）改變代謝途徑 改變分支代謝途徑的流向，阻斷其他代謝途徑的合成，提高目的產(chǎn)物。,1. 加速限速反應(yīng)（以頭孢霉素C為例） 青霉素N是頭胞霉素合成的中間體 用頂頭孢發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)青霉素N的積累 下一步酶反應(yīng)是頭胞霉素合成的限速步驟 乙酰氧基頭胞霉素C合成酶 克隆了這個酶的基因（cefEF），并轉(zhuǎn)化到頂頭孢中 轉(zhuǎn)化子頭胞霉素C產(chǎn)量提高了,A,C,B,加速,2. 改變分支代謝流向 提

17、高代謝分支點的某一代謝途徑酶系的活性，在與另外的分支代謝途徑的競爭中占優(yōu)勢 在lys合成中，選育出解除了反饋抑制和缺失高絲氨酸脫氫酶的突變株，提高了lys產(chǎn)量,A,B,D,缺失,3. 構(gòu)建代謝旁路 大腸桿菌糖代謝的末端產(chǎn)物乙酸達到一定濃度時會對細胞的生長產(chǎn)生抑制作用 將枯草桿菌乙酰乳酸合成酶基因克隆到大腸桿菌，使大腸桿菌中乙酸濃度保持在不引起細胞中毒的濃度以下,A,C,B,F,代謝旁路,（二）擴展代謝途徑 在引入外源基因后，使原來的代謝途徑向后延伸，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物 使原來的代謝途徑向前延伸，可以利用新的原料合成代謝產(chǎn)物,A,B,D,E,E,釀酒酵母不能直接利用淀粉產(chǎn)生乙醇 將淀粉酶基因克隆轉(zhuǎn)化后，表達效率很低 用巴斯德畢氏酵母抗乙醇阻遏的醇氧化酶基因啟動子表達淀粉酶基因，效率較高,（三）轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑 克隆少數(shù)基因，使原來無關(guān)連的兩條代謝途徑聯(lián)系起來，形成新的途徑，合成新的產(chǎn)物 將催化某一代謝途徑的基因組克隆到另一微生物中，使之發(fā)生代謝轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生目的產(chǎn)物,1. 轉(zhuǎn)移代謝途徑 真氧產(chǎn)堿菌（Alcaligenes eutrophus）可產(chǎn)生聚羥基丁酸（PHB）和聚