1、第四章 細(xì)胞融合,一、概述 二、細(xì)胞融合的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展 三、細(xì)胞融合的意義 四、自發(fā)融合 五、細(xì)胞融合的機(jī)理 六、誘導(dǎo)融合 七、體細(xì)胞雜種的遺傳 八、展望,一 、概述,細(xì)胞融合（cell fusion）：是兩個(gè)或更多細(xì)胞通過膜融合形成單個(gè)細(xì)胞的過程。,二、細(xì)胞融合的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展,1938年，Muller首次發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞間的融合現(xiàn)象脊椎動(dòng)物腫瘤細(xì)胞的多核現(xiàn)象。其后科學(xué)家們相繼在肺結(jié)核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。 1875年，科學(xué)家們?cè)谕艿难?xì)胞中也看到了多核細(xì)胞的現(xiàn)象，但是當(dāng)時(shí)科學(xué)發(fā)展水平的限制，沒有給予足夠重視。 在細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)出現(xiàn)后，Lambert 首次報(bào)道體外培

2、養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞有10-210-6 自發(fā)融合概率。,1960年，法國的Barski等首先發(fā)現(xiàn)，兩種不同類型的細(xì)胞在混合培養(yǎng)的過程中會(huì)自發(fā)融合形成融合細(xì)胞。 1962年日本學(xué)者Okada發(fā)現(xiàn)一種日本血細(xì)胞凝集病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，用滅活的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生了第一個(gè)種間的雜交細(xì)胞。 以后人工誘導(dǎo)體細(xì)胞融合逐漸成為一門技術(shù)發(fā)展起來，建立了更有效的融合和選擇雜交細(xì)胞的方法。廣泛應(yīng)用于種間、屬間、科間，乃至動(dòng)植物細(xì)胞間的融合，從而發(fā)展成為一門無論在生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究，或在醫(yī)學(xué)、生物工程的應(yīng)用研究方面均具廣闊前景的細(xì)胞工程技術(shù)。,三、細(xì)胞融合的意義,自發(fā)融合現(xiàn)象在

3、自然界中并不多見，可以在受精過程、肌管形成過程、巨噬細(xì)胞的吞噬作用、 巨噬細(xì)胞形成巨細(xì)胞合胞體 （syncytia of giant cells）、病毒感染細(xì)胞過程,四、自發(fā)融合（spontaneous fusion）, 受精過程,舉例：, 肌管的形成, 巨細(xì)胞,五、細(xì)胞融合的機(jī)理,細(xì)胞融合實(shí)際上包括多個(gè)過程：首先是兩個(gè)親本細(xì)胞并列，細(xì)胞膜相接觸，以后膜局部破壞，最終形成包圍融合細(xì)胞的連續(xù)胞膜。 融合細(xì)胞表現(xiàn)的特征性變化：出現(xiàn)膜成分和胞質(zhì)成分的交流以及細(xì)胞內(nèi)電導(dǎo)率的連續(xù)性。,Singer and Nicolsons Model of membrane structure: The fluid-

4、mosaic model is the “central dogma” of membrane biology.,The core lipid bilayer exists in a fluid state, capable of dynamic movement. Membrane proteins form a mosaic of particles penetrating the lipid to varying degrees.,The Fluid Mosaic Model, proposed in 1972 by Singer and Nicolson, had two key fe

5、atures, both implied in its name.,An Overview of membrane functions,1. Define the boundaries of the cell and its organelles. 2. Serve as loci for specific functions. 3. provide for and regulate transport processes. 4. contain the receptors needed to detect external signals. 5. provide mechanisms for

6、 cell-to-cell contact, communication and adhesion,融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜的變化過程,類脂質(zhì)分子發(fā)生擾動(dòng)和重排 導(dǎo)致細(xì)胞橋的形成 細(xì)胞質(zhì)、核相互融合,在離體的條件下，采用生物、化學(xué)或是物理的方法促使兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融合，形成一個(gè)雜種細(xì)胞的過程。目前誘導(dǎo)融合廣泛進(jìn)行的是體細(xì)胞的融合, 融合的結(jié)果是產(chǎn)生一個(gè)雜交細(xì)胞（hybrid，也有稱之為雜種細(xì)胞），所以體細(xì)胞的融合也稱之為體細(xì)胞雜交（somatic hybridization）。,六、誘導(dǎo)融合（induced cell fusion）,（一）誘發(fā)細(xì)胞融合的方法 （二）融合細(xì)胞的篩選 （三）融合細(xì)胞的克

7、隆化 （四）融合細(xì)胞的應(yīng)用,（一）誘發(fā)細(xì)胞融合的方法,1.病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合 2.化學(xué)融合劑誘發(fā)細(xì)胞融合 3.電融合,1.病毒誘導(dǎo)的融合,病毒類是研究的最早的促融劑，一些致癌、致病病毒如皰疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等，都能誘導(dǎo)細(xì)胞融合，但由于毒性大，應(yīng)用上收到很大限制。,仙臺(tái)病毒（HVJ）是一類被膜病毒，屬于副黏液病毒，又稱副流感病毒1或日本凝血病毒。圓球形，由RNA、衣殼和囊膜組成。病毒被膜含有糖蛋白，其表面還布有許多神經(jīng)氨酸酶（唾液酸酶）和凝血活性的突起。 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的不是仙臺(tái)病毒內(nèi)部的RNA，而是它的外膜。 那么？,HN蛋白具有識(shí)別唾液酸受體的能力，當(dāng)HN蛋白與細(xì)胞表面的

8、唾液酸受體結(jié)合后，復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。F蛋白插入靶細(xì)胞中，促使膜融合。同時(shí)釋放融合縮氨酸進(jìn)入細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞融合。,滅活后的病毒顆粒結(jié)合到細(xì)胞表面。兩受體細(xì)胞開始凝聚。 兩細(xì)胞的膜緊密結(jié)合。病毒被膜與受體細(xì)胞的漿膜融合。病毒顆粒周圍的膜脫離整個(gè)膜，產(chǎn)生破口，在兩細(xì)胞間形成細(xì)胞質(zhì)通道（37、1-2min），通道繼續(xù)擴(kuò)大，病毒顆粒流入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)互相融合。 融合細(xì)胞變圓，融合結(jié)束。,每一細(xì)胞必須有足夠數(shù)量的病毒顆粒附在細(xì)胞膜上，細(xì)胞才能凝集。 凝集要在4 中進(jìn)行，幾分鐘內(nèi)可見細(xì)胞聚集成小團(tuán)。 融合要在較高溫度中進(jìn)行，一般為37 。,2.化學(xué)融合劑誘發(fā)細(xì)胞融合,它們主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙

9、烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷酯、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、甘油醋酸酯、油酸、油胺和二價(jià)陽離子載體等。其中則以PEG的使用最為廣泛。,聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。商品名卡波蠟Carbowax, 分子量20020000，靠醚鍵的聯(lián)結(jié)使其分子末端帶弱負(fù)電荷，目前已衍生達(dá)50多種。 1975年Kao和Chayluk報(bào)道PEG(polyethylene glycol,PEG)可促進(jìn)細(xì)胞融合， Pontecorvo報(bào)道PEG促融效率高于仙臺(tái)病毒100-300倍。,3. 電融合技術(shù),1981年，Scheur

10、ich 和Zimmermann發(fā)明了電誘導(dǎo)細(xì)胞融合法，簡稱電融合。電融合是指將親本細(xì)胞置于交變電場(chǎng)中，使它們彼此靠近，緊密接觸，并在兩個(gè)電極間排列成串珠狀，然后在高強(qiáng)度、短時(shí)程的直流電脈沖作用下，相互連接的兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的質(zhì)膜被擊穿而導(dǎo)致細(xì)胞融合。,融合參數(shù)：主要包括交流電壓、交變電場(chǎng)的振幅頻率、交變電場(chǎng)的處理時(shí)間；直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等。,優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單；適用范圍廣；無需外源 因子；毒性低；融合率高；參數(shù)易控制； 可用于微量細(xì)胞融合；可在顯微鏡觀察下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合并直接挑選雜交細(xì)胞。,缺點(diǎn)： 儀器昂貴，在融合大小不同細(xì)胞時(shí)存在問題；在融合膜成分差異較大的細(xì)胞時(shí)存在困難,（二）

11、融合細(xì)胞的篩選,細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過程，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞，從而解決融合細(xì)胞的選擇問題。,基于酶缺陷型細(xì)胞 基于藥物抗性所建立的雜種篩選 3. 基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選 4. 由溫度敏感突變型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選 5. 具有所需性狀的雜種細(xì)胞的篩選,1. HAT選擇系統(tǒng)基于酶缺陷型細(xì)胞雜種篩選,HAT是含一定濃度次黃嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤（ Aminopterin，A ）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。 DNA合成途徑有

12、兩種:,需兩種酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶: （催化胸腺嘧啶核苷產(chǎn)生脫氧胸苷酸） 次黃嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶HGPRT酶: （催化次黃嘌呤產(chǎn)生肌苷）,主要途徑由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸是必不可少的媒介，參與嘌呤和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制FH2活性，阻斷FH2到FH4合成。,基于HAT培養(yǎng)基的篩選系統(tǒng),H（Hypoxanthine次黃嘌呤）應(yīng)急途徑中所提供之外源核苷 酸前體 A（Aminopterin，氨基喋呤）阻斷核苷酸的從頭合成 T（Thymidine，胸腺嘧啶）應(yīng)急途徑中所提供之外源核苷酸前體,HGPRT酶缺陷型細(xì)胞株（長期培養(yǎng)系）,不能在HAT培養(yǎng)液中生長,正

13、常細(xì)胞,體外生存能力有限，最終也將死亡,融合細(xì)胞,最后，只有融合細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中存活,2. 利用抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細(xì)胞對(duì)藥物敏感性差異篩選雜種細(xì)胞。 親本A：對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)卡那霉素不敏感 親本B：對(duì)卡那霉素敏感，對(duì)氨芐青霉素不敏感 雜種細(xì)胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長,3.營養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)：細(xì)胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時(shí)，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。 親本A：色氨酸缺陷型 親本B：蘇氨酸缺陷型 雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。,4.溫度敏感突變型雜種細(xì)胞的篩選：一般的培養(yǎng)細(xì)胞能在37

14、度范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型的細(xì)胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細(xì)胞。 親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長。 親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡那霉素。 雜種細(xì)胞能在高溫和含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長。,（三）融合細(xì)胞的克隆化,克隆化的目的就是利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的、能表達(dá)特定性狀的細(xì)胞系。 其主要方法有： 有限稀釋法、半固體培養(yǎng)基法、顯微操作法、熒光激活分選法。,（四）融合細(xì)胞的應(yīng)用,1.基因定位 不同種屬的細(xì)胞融合時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)一個(gè)親本細(xì)胞的染色體被優(yōu)先排除，而另一個(gè)親本的染色體被選擇性留下，即染色體分離的現(xiàn)象。由此，可根據(jù)表型和與表型特征相對(duì)應(yīng)的基因在特定染色體上進(jìn)行定位。 例如 ：HGPRT人細(xì)胞與TK的小鼠細(xì)胞融合后，可用HAT培養(yǎng)基分離得到一種僅含一條人E組染色體的雜種細(xì)胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E組染色體上的。,2.體細(xì)胞雜種的致瘤性分析 通過正常二倍體細(xì)胞和致瘤性或病毒轉(zhuǎn)化 細(xì)胞的融合來進(jìn)行致瘤性的遺傳分析。 3.遺傳缺陷的基因互補(bǔ) 基于雜種細(xì)胞的基因互補(bǔ)作用，可分為基因間和基因內(nèi)的互補(bǔ)作用，即雜種細(xì)胞可以具有兩種親本在遺傳上缺陷的基因表型。通過這種基因互補(bǔ)，可以用正?；騺碇委?/p>