1、第四章 細(xì)胞反應(yīng)過程動力學(xué),2,4.1.1 簡介,一個活的細(xì)胞 = 一個復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)器,化學(xué)反應(yīng)的一些概念也可以應(yīng)用到生物系統(tǒng)中來。,4.1 化學(xué)計量學(xué),化學(xué)反應(yīng),3,代謝：細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的所有化學(xué)反應(yīng)的總和稱代謝,分解代謝 營養(yǎng)物的降解,合成代謝,4,培養(yǎng)基組成 = 營養(yǎng)物的降解,細(xì)胞為了生長和繁殖，必須消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分用于合成細(xì)胞壁，蛋白質(zhì)，酶，脂肪等物質(zhì)和細(xì)胞構(gòu)成單元。,元素的基本來源,5,產(chǎn)物合成,醇 (乙醇), 有機(jī)酸 (乳酸, 檸檬酸,氨酸酸),抗生素, 酶,這些物質(zhì)的大量合成，對于微生物細(xì)胞的正常功能維持可能是沒有必要的或者是無用的，但對于人類卻是很有價值的。,6,Cell

2、Growth And Energy Release,Energy obtained from environment is stored and shuttled in high-energy intermediates, such as ATP,The cell uses this energy to perform three types of work:,Chemical synthesis of large or complex molecules;,Transport of ionic and neutral substrates into or out of the cell or

3、 its internal organelles;,Mechanical work required for cell division and motion.,All these processes are, by themselves, nonspontaneous, and result an increase of free energy of the cell. Consequently, they occur when simultaneously coupled to another process which has a negative free energy change

4、of greater magnitude.,7,Example : Oxidation-Reduction,8,(II) 化學(xué)計量學(xué) 得率系數(shù),Simplest Macroscopic View of Growth,System: Fixed Amount of Cell Material,9,(a) 元素平衡,Consider the following simplified biological conversion in which no extracellular products other than H2O and CO2:,一個典型的細(xì)胞組成可以表示為：,We postulate

5、 one mole of biological material would be defined as the amount containing one mole of carbon, such as,where : 1mole of carbohydrate; : 1mole of cellular material.,10,Simple elemental balances on C, H, O and N yield the following equations:,11,(b) Other Definitions,The yield coefficients,12,Regulari

6、ty,Some parameters are nearly the same irrespective of the species or substrate involved:,0.462 g carbon in biomass per gram of dry biomass; typical bacteria composition: CH1.8O0.5N0.2,And most measured values of YX/S for aerobic growth on glucose are 0.380.51 g DW/g glucose.,13,YX/S值保持不變的條件： 化學(xué)合成培養(yǎng)

7、基 唯一碳源 無胞外產(chǎn)物或生長偶聯(lián)型 胞內(nèi)不積累貯藏性能源物質(zhì) YX/S的應(yīng)用 在實際發(fā)酵過程中常常隨不同生理狀態(tài)而變化 明確底物的消耗狀況 跟蹤營養(yǎng)物的流向,14,4.2 細(xì)胞生長動力學(xué)概述,決定細(xì)胞反應(yīng)動力學(xué)的主要因素、現(xiàn)象及其相互關(guān)系,非生命體系,生命體系,在細(xì)胞生長的過程中，包含兩個相互作用的系統(tǒng)： 培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞體,15,非生命體系,生命體系,細(xì)胞消耗營養(yǎng)成分，將培養(yǎng)環(huán)境中的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。,細(xì)胞在生命活動中產(chǎn)生熱量，與此同時，通過設(shè)置培養(yǎng)環(huán)境的溫度控制細(xì)胞的生長或產(chǎn)物合成。,細(xì)胞生長、增殖和代謝產(chǎn)物的積累，使培養(yǎng)環(huán)境的流變學(xué)性質(zhì)(固含量、粘度)發(fā)生改變，細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的機(jī)械相互作

8、用趨于明顯，對于動物細(xì)胞培養(yǎng)過程的影響尤為顯著。,16,4.2 生長動力學(xué)的定量描述,對發(fā)酵過程的動力學(xué)描述不僅對于理論研究很有用，而且能應(yīng)用于實際優(yōu)化發(fā)酵過程和反應(yīng)器的設(shè)計之中.,對研究系統(tǒng)中的各變量變化過程進(jìn)行數(shù)學(xué)描述.,平衡方程,(物料衡算, 能量衡算),熱力學(xué),(狀態(tài)方程, 亨利定理),反應(yīng)速率方程,(傳質(zhì), 細(xì)胞和產(chǎn)物合成速率、底物的消耗速率),17,4.2.1 平衡方程,平衡方程的一般形式,體系中的積累速率:,細(xì)胞濃度: X ( kg m-3 ),反應(yīng)器體積: V ( m3 ),細(xì)胞的質(zhì)量: VX ( kg ),細(xì)胞的積累速率 = ( kgh-1 ),單位體積細(xì)胞的積累速率,= (

9、 kgm-3h-1 ),體系中的積累速率流入體系的速率-流出體系的速率,18,流入速率與流出速率:,where F 體積流量 ( m3h-1 ) FX 質(zhì)量流量 ( kgh-1 ) V 反應(yīng)器體積 (m3),下標(biāo), i or o, 表示流入(input)或流出(output)反應(yīng)器的變量.,合成速率與消耗速率:,細(xì)胞合成速率 = rX ( kgm-3h-1 ),產(chǎn)物合成速率 = rP ( kgm-3h-1 ),底物消耗速率 = rS ( kgm-3h-1 ),19,4.2.2 動力學(xué)模型,非分離模型,分離模型,非結(jié)構(gòu)模型,結(jié)構(gòu)模型,對細(xì)胞生長過程的不同理解產(chǎn)生了不同的動力學(xué)模型,是否分別描述細(xì)

10、胞的各種組成成分,是否將細(xì)胞看成是均一的種群,20,非結(jié)構(gòu)模型,結(jié)構(gòu)模型,將細(xì)胞種群看成是均一單一組分的溶質(zhì),Single component heterogeneous individual cells,Multicomponent average cell description,將細(xì)胞種群看成是多組分多種群的生物系統(tǒng),最理想的模型,最接近現(xiàn)實的模型,對細(xì)胞生長過程的不同理解產(chǎn)生了不同的動力學(xué)模型,非分離模型,分離模型,21,生長速率 (kg m-3 h-1) 底物消耗速率 (kg m-3 h-1) 產(chǎn)物合成速率 (kg m-3 h-1),符號定義,比生長速率 (h-1) 底物比消耗速率

11、(h-1) 產(chǎn)物比合成速率 (h-1),22,細(xì)胞生長動力學(xué) (X),產(chǎn)物合成動力學(xué) (P),底物消耗動力學(xué) (S),細(xì)胞反應(yīng)動力學(xué),23,細(xì)胞生長與抑制,底物限制生長,假定一種化合物S是限制性底物 (即S的濃度增加會影響生長速率,而其它營養(yǎng)組分濃度的變化對生長速率沒有影響作用).,a) Monod 方程,假設(shè)條件： 均衡生長 只有一種限制性基質(zhì) 細(xì)胞得率系數(shù)為常數(shù),24,where 比生長速率 ( h-1 ) 最大比生長速率 ( h-1 ) 飽和常數(shù) ( kgm-3 ),典型的非結(jié)構(gòu)非分離動力學(xué)模型是Monod equation, 它的方程表達(dá)形式類似于酶的Michaelis-Menten

12、方程:,半經(jīng)驗公式,25,類似于酶反應(yīng)動力學(xué)所提示的規(guī)律, 從Monod方程也可以推衍出一些有用的結(jié)論：,優(yōu)點: Monod 方程能適合于許多實驗和生產(chǎn)過程中的微生物生長過程，適用面較廣。,缺點:,a. 僅適用于生長速率較慢的情況,b. 僅適用于細(xì)胞濃度較低的條件,26,對于快速生長密度較高的微生物培養(yǎng)過程:,or,where S0 底物的初始濃度 KS0 無綱量系數(shù),其它方程:,優(yōu)點: 對實驗數(shù)據(jù)的擬合效果優(yōu)于Monod方程; 缺點: 方程不連續(xù).,Blackman equation,Tessier 方程,27,Moser 方程,當(dāng) n=1 和Monod方程等效.,Contois 方程,一般

13、形式下的微分方程:,28,General form, a single differential equation:,Constants of the Generalized Differential Specific Growth Rate Equation for Different Models,29,生長非偶聯(lián)型 (次級代謝物),產(chǎn)物合成動力學(xué),生長偶聯(lián)型 (乙醇發(fā)酵),or,or,30,Leudeking-Piret 方程,生長半偶聯(lián)型: (乳酸發(fā)酵),or,It has proved extremely useful and versatile in fitting product

14、 formation data from many different fermentations. This is an expected kinetic form when the product is the result of energy-yielding metabolism, as in several anaerobic fermentations.,31,內(nèi)源性的代謝維持,系數(shù)范圍: ms = 0.024 (kg 底物/kg 細(xì)胞h-1),在微生物不生長也不生產(chǎn)產(chǎn)物時，仍消耗底物，這是為了滿足微生物的維持需要，支持細(xì)胞存活、細(xì)胞運(yùn)動、酶合成、滲透壓、營養(yǎng)貯存和其它過程。,32

15、,底物消耗動力學(xué),where the expressions of rPi could be one of the above three product formation rate equations, according to the characteristics of the corresponding product (growth-associated or not).,對于有許多產(chǎn)物合成的發(fā)酵過程，底物的消耗速率可以表示為：,Also,用于細(xì)胞生長,用于產(chǎn)物合成,代謝維持,33,細(xì)胞生長動力學(xué) (X),產(chǎn)物合成動力學(xué) (P),底物消耗動力學(xué) (S),細(xì)胞反應(yīng)動力學(xué),34,4.3

16、 分批培養(yǎng)的動力學(xué)方程,生長條件是不穩(wěn)定的，一直在變化的：隨著細(xì)胞生長過程的進(jìn)行，反應(yīng)器中的營養(yǎng)物濃度，細(xì)胞濃度，產(chǎn)物濃度都隨反應(yīng)時間而變化。,S, X, P = f(t),這種培養(yǎng)方式很簡單，因此廣泛地在實驗室和生產(chǎn)實踐中應(yīng)用。,35,4.3.1 Introduction,典型的大腸桿菌生長曲線,生長曲線可分為4個時期.,36,37,延滯期,接種后，細(xì)胞的生長進(jìn)入延滯期。這個期間是細(xì)胞的適應(yīng)調(diào)整期，細(xì)胞在一個新的環(huán)境中生存，需要根據(jù)新環(huán)境的營養(yǎng)特點重新調(diào)整細(xì)胞體內(nèi)的酶系及代謝過程，以使自身能適應(yīng)新的環(huán)境并開始生長和繁殖。,怎樣減少延滯期的時間 ?,可以讓細(xì)胞有一個預(yù)適應(yīng)的過程，種子的二級培養(yǎng)

17、。,種齡是對數(shù)期的（年青，有生命力）,加大接種量,優(yōu)化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件（化學(xué)組成和物理條件）,加入一些生長因子（微量元素，維生素等）,38,當(dāng)培養(yǎng)基中含有2種碳源時，可能會有多個延滯期的出現(xiàn)。,這種現(xiàn)象稱為二次生長.,當(dāng)一種碳源被利用完后，細(xì)胞還需重新調(diào)整細(xì)胞體內(nèi)的酶系和代謝途徑以適應(yīng)另一種碳源的利用，這需要一個調(diào)整的過程。,二次生長,39,對數(shù)生長期 (Exponential Growth Phase),延滯期結(jié)束后，微生物適應(yīng)了新的環(huán)境，其生長過程進(jìn)入倍增生長的過程，生物量或微生物的數(shù)目隨著分裂周期而倍增。,對數(shù)生長速率方程符合一級動力學(xué)方程,with X = X0, at t = 0 =

18、 constant,積分得到,or,對數(shù)生長的特征是：在半對數(shù)坐標(biāo)系中，以lnX 對 t 作圖,得到一條直線。,40,細(xì)胞的倍增時間:,t,t,lnX,X,41,穩(wěn)定期,在穩(wěn)定期時,細(xì)胞的凈生長速率為0, 即生長速率 = 死亡速率,但是在穩(wěn)定期時，細(xì)胞仍保持著代謝活力并合成次級代謝產(chǎn)物, （非偶聯(lián)型代謝產(chǎn)物）.,死亡期,在穩(wěn)定期結(jié)束時，隨著營養(yǎng)物耗竭，或者是有害代謝副產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致細(xì)胞的生長進(jìn)入死亡期。,細(xì)胞的死亡速率一般遵循一級反應(yīng)動力學(xué),積分得到,where, Xv 活細(xì)胞濃度,XS是穩(wěn)定期時的細(xì)胞濃度,42,4.3.2 分批發(fā)酵動力學(xué) (是一個非穩(wěn)態(tài)的過程),對于分批培養(yǎng): Fi =

19、Fo = 0, then dV/dt = 0,where rSX 用于細(xì)胞生長的底物消耗; rSm用于代謝維持的底物消耗 rSP用于產(chǎn)物合成的底物消耗,43,細(xì)胞生長速率:,產(chǎn)物合成速率:,底物消耗速率:,當(dāng)代謝維持可以忽略時.,注意：不是一個常數(shù),44,應(yīng)用Monod 方程并且不考慮產(chǎn)物的合成，也不考慮代謝維持，只考慮細(xì)胞的生長和底物的消耗時（簡化模型）,(比生長速率),(細(xì)胞對底物得率),這時，YX/S是一個恒定值，且,45,46,If X00, then,對于分批培養(yǎng),47,4.4 參數(shù)估計,積分法,微分法,實驗測得S(t),X(t), 求解微分方程組, 線性化或數(shù)值解,實驗測得反應(yīng)速率

20、， 直接由速率方程估計參數(shù),48,4.4.1 積分法,僅能應(yīng)用于簡單的動力學(xué)模型 First-order kinetics Zero-order kinetics Growth associated product accumulation Logistic equation Monod equation,49,Monod方程的解析解,(1),(2),(3),將(3)代入(2)得：,(4),50,將(1)式變形,(5),將(5)式代入(4)式得：,(6),分離變量后積分得：,式中A和B是與動力學(xué)參數(shù)有關(guān)的復(fù)合參數(shù)。,51,4.4.2 微分法,比生長速率,實驗數(shù)據(jù), X-t, S-t, -t,線性化,52,t,X,S,S,1/S,S,S/,1/,1/max,-1/KS,KS/max,1/max,KS/max,-KS,53,數(shù)值計算求解,非線性微分方程的數(shù)值求解, Runge-Kutta method, (Matlab命令: ode45, ode23.) 優(yōu)化計算 依賴域法 或 遺傳算法 (commands in Matlab: lsqnonlin, fmincon, lsqcurvefit),Least-squares method (最小二乘法),54,積分法 微分法,S(t), X(t),例4-1 Monod 方程參數(shù)的實驗測定：以乳