1、第11章 蛋白質(zhì)組學(xué)及其在微生物學(xué) 研究中的應(yīng)用,第一節(jié) 引言 第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究基本技術(shù) 第三節(jié) 微生物蛋白質(zhì)組學(xué),主要內(nèi)容,第一節(jié) 引言,背 景,基因組時(shí)代 后基因組時(shí)代 核苷酸序列本身很難直接與生命功能和生命現(xiàn)象掛起鉤，而蛋白質(zhì)才是生物功能的最終執(zhí)行者。 蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過(guò)基因數(shù)目。 蛋白質(zhì)隨時(shí)間和空間而變化。,mRNA水平的基因表達(dá)研究取得進(jìn) 展，但mRNA與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0.40.5 蛋白質(zhì)自身特點(diǎn)難以從DNA和mRNA水平得到解答,蛋白質(zhì)組學(xué)的概念,蛋白質(zhì)組是澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出， 被定義為：一個(gè)基因組/一種生物或一種細(xì)胞/組

2、織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。,對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。 同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同 。 在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。,蛋白質(zhì)組是：,蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics),指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容,蛋白質(zhì)表達(dá)模式(或蛋白質(zhì)組組成)的研究 蛋白質(zhì)組組成的分析鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)中的與基因組學(xué)相對(duì)應(yīng)的主要內(nèi)容。它要求對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行表征,即實(shí)現(xiàn)所有蛋白質(zhì)的分離、

3、鑒定及其圖譜化。雙向凝膠電泳(2-D)和質(zhì)譜(Mass spectrometry)技術(shù)是當(dāng)前分離鑒定蛋白質(zhì)的兩大支柱技術(shù),蛋白質(zhì)組功能模式(目前主要集中在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系)的研究,大規(guī)模的蛋白質(zhì)分析過(guò)程,樣品制備 是蛋白質(zhì)組研究的第一步也是最關(guān)鍵的一步。 蛋白質(zhì)分離（技術(shù)）： 二維電泳（核心技術(shù)）、多維色譜 蛋白質(zhì)分析與鑒定（技術(shù)）： 質(zhì)譜技術(shù)（核心技術(shù)）、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù)等。 蛋白質(zhì)組發(fā)展的瓶頸是缺乏自動(dòng)化的蛋白質(zhì)分析的完整途徑。,第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究基本技術(shù),典型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究常分為四個(gè)步驟：,從生物學(xué)物質(zhì)（如細(xì)胞、組織、體液等） 提取蛋白質(zhì)混合

4、液,分離蛋白質(zhì)混合液,將有意義的蛋白質(zhì)消化 成肽進(jìn)行質(zhì)譜分析,將質(zhì)譜獲得的數(shù)據(jù)利用各種 生物信息學(xué)工具進(jìn)行分析,蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展依賴(lài)于高通量分離、鑒定和解析蛋白質(zhì)技術(shù)的進(jìn)步。 重要技術(shù)突破主要包括三點(diǎn)： 固相化PH梯度二維電泳（IPG-2-DE)的發(fā)明與完善； 生物質(zhì)譜，即應(yīng)用軟電離技術(shù)對(duì)生物大分子進(jìn)行分析的質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展； 生物信息學(xué)發(fā)展。,一、蛋白質(zhì)組研究中的蛋白質(zhì)分離,（一）、二維（雙向）凝膠電泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)： 利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量，結(jié)合凝膠化學(xué)特性，分離各種蛋白質(zhì)的方法。,原 理,第一向在高壓電場(chǎng)下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行等電聚焦電

5、泳技術(shù)(IEF)將蛋白質(zhì)混合物按照等電點(diǎn)高低進(jìn)行分離, 再在第一向垂直方向上進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)按照相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。 1975年首先由OFarrell等創(chuàng)立。,特 點(diǎn),可分離10100 kD分子量的蛋白質(zhì) 高靈敏度和高分辨率 便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理 與質(zhì)譜分析匹配,第一向IEF電泳,傳統(tǒng)OFarrell系統(tǒng)雙向電泳的缺陷。 pH凝膠制作的不穩(wěn)定和重復(fù)性差限制了等點(diǎn)聚焦電泳技術(shù)的應(yīng)用， Bjellgvist等發(fā)展并完善了固相pH梯度等電聚焦技術(shù)，Grg等成功地將之應(yīng)用于雙向電泳。 優(yōu)點(diǎn),固相pH梯度等電聚焦的優(yōu)點(diǎn),克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂

6、移等缺點(diǎn)。 穩(wěn)定的可以隨意精確設(shè)定的pH梯度。 尤其可在較窄的pH范圍內(nèi)進(jìn)行第二輪分析，大大提高了分辨率及重復(fù)性。,第二向SDS-PAGE電泳,垂直板電泳 水平超薄膠電泳,雙向電泳典型過(guò)程包括：,蛋白質(zhì)樣品制備：要防止蛋白質(zhì)酶降解蛋白質(zhì)。 上樣 一種是IPG膠條重泡脹衙利用加樣杯邊運(yùn)行等點(diǎn)聚焦邊上樣。 別一種是將樣品與重泡脹液混合，在IPG膠條泡脹的同時(shí)樣品出參入了膠條。 IPG的運(yùn)行和平衡 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 膠上蛋白質(zhì)檢測(cè)和定量： 熒光染色靈敏度比考染高而與銀染相仿，線(xiàn)性范圍要遠(yuǎn)高地銀染，與質(zhì)譜兼容性好。 圖像采集、分析及數(shù)據(jù)處理,2-DE技術(shù)的缺點(diǎn), 所能分離的蛋白質(zhì)的性質(zhì)有一定限

7、制，如蛋白質(zhì)分離范圍一般為8200kD，對(duì)極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，包含信號(hào)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的低豐度蛋白質(zhì)難于有效分離。 在2D膠上有些蛋白質(zhì)點(diǎn)量太少，難以進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，自動(dòng)化程度低難于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化性質(zhì)聯(lián)用。,2、新型非凝膠技術(shù),高效液相色譜法 High performance liquid chromatography，HPLC 毛細(xì)管電泳 capillary electrophoresis，CE 液相等點(diǎn)聚焦和毛細(xì)管色譜 capillary electrochromatography 特點(diǎn)： 自動(dòng)化程度高、分辨率高，檢測(cè)限低。,采用凝膠技術(shù)和非凝膠技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)

8、研究的基本路線(xiàn),在非凝膠分離技術(shù)中，高效液相色譜由于其分離原理多樣，易于組合多維分離模式和與質(zhì)譜直接聯(lián)用而獲得了廣泛的研究和應(yīng)用。 高效液相色譜的原理：溶于流動(dòng)相中各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，與固定相發(fā)生相互作用，由于相互作用大小、強(qiáng)弱的不同，各組分在固定相中滯留的時(shí)間不同，由此從固定相中流出的先后也不同，最終使不同組成成分得到分離。 經(jīng)典的高效液相色譜系統(tǒng)由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)成。質(zhì)譜起到了檢測(cè)器的作用。,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）,蛋白質(zhì)混合物直接通過(guò)液相色譜分離以代替2-DE的分離，然后進(jìn)入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量，再通過(guò)串聯(lián)MS技術(shù)，得到部分序列信息，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)

9、查詢(xún)、鑒定蛋白質(zhì)。,根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性及疏水性不同，用MS分離多肽復(fù)合物。,多維色譜技術(shù)（LC/LC-MS/MS）,多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(multidimensional protein identification technology) 從色譜柱中流出有多肽直接進(jìn)入質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。,二、生物質(zhì)譜與蛋白質(zhì)鑒定,（一）、基本原理 質(zhì)譜技術(shù)的基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來(lái)分離并確定樣品的分子量。 個(gè)完整的質(zhì)譜分析儀由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)5個(gè)部分組成, 四極桿質(zhì)譜（quadrupole,Q）、 離子阱質(zhì)譜（ion trap,I

10、T） 飛行時(shí)間質(zhì)譜（ time of flight ，TOF ） 傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（fourier transform cyclotron resonance, FTICR）,常用的質(zhì)譜分析技術(shù),電噴霧離子化（electrospray ionization ， ESI） 和基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix-assisted laser desorption ionization ，MALDI）等軟電離技術(shù)的發(fā)明和成熟才使質(zhì)譜技術(shù)真正應(yīng)用到生物大分子分析領(lǐng)域，使得在fmol(10-15)乃至attomole(10-18)水平檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量高達(dá)幾十萬(wàn)的生物大分子成為可能。這也使得有機(jī)

11、質(zhì)譜發(fā)展成為了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域生物質(zhì)譜。,電噴霧離子化：是利用噴口的高電場(chǎng)使質(zhì)譜儀進(jìn)樣端毛細(xì)管柱流出的含有樣品的液體成為帶電荷的微滴。隨著揮發(fā)性溶劑的蒸發(fā)，微滴半徑減少而表面電荷密度增加，直至達(dá)到一定臨界值，液滴爆裂為帶電荷的子微滴。這一過(guò)程不斷重復(fù)使最終的微滴非常細(xì)小呈霧狀。這時(shí)液滴表面的電場(chǎng)很強(qiáng)，使蛋白質(zhì)等被分析分子離子化并以帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子的形式進(jìn)入氣相。,基質(zhì)輔助激光解吸電離：是將樣品均勻包埋在固體基質(zhì)并形成晶體，當(dāng)用337nm的氮激光照射晶體時(shí)，基質(zhì)吸收激光提供的能量而汽化，樣品分子解吸附，基質(zhì)樣品間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離。,“軟電離”的特點(diǎn),分子電離時(shí)保留整個(gè)分子的完整性，

12、不會(huì)形成碎片離子。 靈敏度高、快速、能同時(shí)提供樣品的精確分子量和結(jié)構(gòu)信息、既可定性又可定量、并能有效地與各種色譜聯(lián)用來(lái)分析復(fù)雜體系。,在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，為了提高質(zhì)譜的適用范圍和工作性能，常將不同類(lèi)型的質(zhì)量分析器串聯(lián)起來(lái)使用。因此，目前最為常用的質(zhì)譜分析系統(tǒng)包括兩大類(lèi)： 以單一質(zhì)譜為基礎(chǔ)的 電噴霧三級(jí)四級(jí)桿質(zhì)譜 電噴霧離子阱質(zhì)譜 電噴霧傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜 基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜 以串聯(lián)質(zhì)譜為基礎(chǔ)的 電噴霧三級(jí)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜 基質(zhì)輔助激光解吸離子化三級(jí)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜 基質(zhì)輔助激光解吸離子化串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜,（二）、應(yīng)用生物質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì),肽質(zhì)量指紋譜（peptide

13、mass fingerprinting，PMF）是蛋白質(zhì)的一種重要屬性，也是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中鑒定蛋白質(zhì)的常春藤用研究方法之一。1993年由多研究小組分別獨(dú)立提出。 肽質(zhì)量指紋譜指的是蛋白質(zhì)被酶切位點(diǎn)專(zhuān)一的蛋白酶切割后得到的一套特征性有肽片斷質(zhì)量圖譜。由于每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列都不相同，蛋白質(zhì)被特異性的蛋白酶消化后所產(chǎn)生的肽片斷序列及其質(zhì)量的構(gòu)成也具有特異性，可用于與數(shù)據(jù)庫(kù)中所有蛋白質(zhì)酶解的理論肽質(zhì)量譜匹配來(lái)鑒定蛋白質(zhì)。 目前測(cè)定肽混合物質(zhì)量質(zhì)量譜最有效的質(zhì)譜儀是基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS)，適合測(cè)定的相對(duì)分子質(zhì)量范圍在五百到數(shù)千道爾頓，并需要用已知相對(duì)分子

14、質(zhì)量的蛋白質(zhì)作內(nèi)標(biāo)。,鑒定和注釋蛋白質(zhì)的路線(xiàn),通過(guò)肽質(zhì)量譜指紋圖（peptide mass fingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配 通過(guò)測(cè)出樣品中部分肽段二級(jí)質(zhì)譜信息或氨基酸序列標(biāo)簽和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配,儀 器,MALDI-TOFMS質(zhì)譜儀：靈敏度高（可達(dá)fmol），分析速度快，譜圖簡(jiǎn)單易于解析以及受緩沖液、鹽份的干擾小 . 缺點(diǎn)：只能鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)存在的蛋白質(zhì)，而且有一部分蛋白質(zhì)在只有PMF信息時(shí)不能得到可靠的鑒定，因此需要進(jìn)一步分析肽段的序列信息來(lái)鑒定蛋白質(zhì),串聯(lián)質(zhì)譜的肽序列標(biāo)簽（PST） 應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜中得到的部分氨基酸序列結(jié)合此序列前后的離子質(zhì)量和肽段母離子質(zhì)量，在數(shù)據(jù)庫(kù)中

15、檢索以鑒定蛋白質(zhì)，稱(chēng)為肽序列標(biāo)簽技術(shù)。 相比單獨(dú)的肽質(zhì)量指紋譜技術(shù)，PST搜索數(shù)據(jù)庫(kù)得到的結(jié)果更可信。 一般串聯(lián)質(zhì)譜儀電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MS/MS)可用于肽段序列的測(cè)定。,組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù) 兩級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF） 傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜（FTMS） 表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）,聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì),概念：把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜體系中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定。,（三）、定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究,低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)困難 蛋白質(zhì)表達(dá)量差異很小，如在50%以下時(shí)，精確定量成為瓶頸 蛋白質(zhì)表達(dá)的瞬時(shí)變化

16、,蛋白質(zhì)定量的難點(diǎn),目前常用的蛋白質(zhì)組定量方法包括： 1、基于熒光染色技術(shù)的電泳定量法 2、基于穩(wěn)定同位素技術(shù)的質(zhì)譜定量法,1基于熒光染色技術(shù)的電泳定量法,雙向凝膠電泳(2-DE)是目前唯一能分離展示大量蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析的一種方法。 熒光差異顯示雙向電泳（F-2D-DIGE）,用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的熒光染料有兩大類(lèi)： 一類(lèi)能與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的熒光染料，如花菁染料Cy3,Cy5. 另一類(lèi)是非共價(jià)結(jié)合熒光染料，包括苯乙烯基染料 Sypro系列、尼羅河紅等。 熒光染色常用的方式有兩種： 二維電泳前進(jìn)標(biāo)記 電泳后標(biāo)記,2、基于穩(wěn)定同位素技術(shù)的質(zhì)譜定量法,同位素標(biāo)記法基本原理：將待比較的一對(duì)肽段樣品

17、中的一個(gè)進(jìn)行同位素標(biāo)記，另一個(gè)不標(biāo)記，標(biāo)記和未標(biāo)記的同一肽段，其色譜行為一致的，進(jìn)而可以利用它們的質(zhì)量差異確定在質(zhì)譜儀中的信號(hào)對(duì)，通過(guò)比較信號(hào)對(duì)之間相對(duì)強(qiáng)弱就可以準(zhǔn)確地計(jì)算標(biāo)記和未標(biāo)記肽段的相對(duì)豐度。 同位素標(biāo)記方法有： 體內(nèi)標(biāo)記（代謝標(biāo)記） 體外標(biāo)記：根據(jù)標(biāo)記部位又可分為：巰基（SH）標(biāo)記、氨基標(biāo)記和羧基標(biāo)記,三、 微生物蛋白質(zhì)組學(xué),（一）病毒微生物蛋白質(zhì)組學(xué) 由于病毒微生物與感染性疾病密切相關(guān)，研究這些致病微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)于了解其毒性因子、抗原以及疫苗的制備非常重要。 在已完成基因組測(cè)序的47種致病蘇白及其菌株中，有14種已進(jìn)行過(guò)蛋白質(zhì)組研究，其中對(duì)大腸埃希菌、流感嗜血桿菌、結(jié)合分支桿

18、菌等三種菌還進(jìn)行過(guò)模式菌和臨床致病菌的差異蛋白質(zhì)組比較研究。,病原微生物蛋白質(zhì)組研究主要有以下幾方面： （1）遺傳與變異方面的研究 主要是通蛋白質(zhì)研究結(jié)果與基因組預(yù)測(cè)的（開(kāi)放閱讀框）ORF相比較來(lái)較正基因組的研究結(jié)果。蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果可以對(duì)基因組的研究結(jié)果起到補(bǔ)充和修正的作用，而且通過(guò)同一致病菌不同菌株的蛋白質(zhì)研究，可以對(duì)病株進(jìn)行分類(lèi)。,（2）病原菌致病機(jī)理及毒力因子的研究 通過(guò)在整體水平上比較病原菌和非致病菌的蛋白質(zhì)譜，以及在各種環(huán)境下致病菌毒力和蛋白質(zhì)譜的變化，可以發(fā)現(xiàn)致病株的毒力調(diào)控機(jī)制和毒力因子。 （3）研究宿主和微生物的相互關(guān)系，尋找免疫靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)新型疫苗 蛋白質(zhì)組研究方法與免疫雜交方法相結(jié)合的研究已廣泛應(yīng)用于宿主對(duì)病原菌的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答研究中，并形成了蛋白質(zhì)的一個(gè)新的分支免疫蛋白質(zhì)組。通過(guò)細(xì)菌蛋白質(zhì)組與宿主多克隆血清的雜交反應(yīng)，可以發(fā)現(xiàn)新的抗原決定因子群，以用于疫苗開(kāi)發(fā)和診斷分析。,（4）藥物抗性的研究 通過(guò)抗性菌株與敏感菌株的差異蛋白質(zhì)組研究，可以對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)抗藥性相關(guān)因子，為新藥研究提供線(xiàn)索。 （5）抗菌藥物的開(kāi)發(fā) 首先是通過(guò)分析細(xì)菌對(duì)抗菌藥物有不同的反應(yīng)的菌株的蛋白質(zhì)組可以尋找新的抗菌藥物篩選靶點(diǎn)和模式。而利用一組作用位點(diǎn)類(lèi)似的抗菌藥