1、實驗室常用檢測技術(shù)簡要介紹,主要內(nèi)容,概述 疾病鑒別診斷過程 臨床癥狀和大體病變檢 病料的采集及處理 實驗室檢驗 病料中細(xì)菌的檢測 病料中病毒的檢測,一 、疾病鑒別診斷過程,臨床標(biāo)本的采集及處理 原則 合理的采樣時機 正確的采樣方法 適宜的采樣部位,一 、標(biāo)本采集 盡量在病程的早期采集；標(biāo)本應(yīng)放置無菌容器中；標(biāo)本應(yīng)做適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，如動物、地點、時間、暫定的診斷等。 1 唾液在生理理鹽水中常加0.5%明膠或BSA，以保護不穩(wěn)定病毒。 2 鼻、咽及肛門拭子 3 糞便標(biāo)本 4 腦脊髓液、心包液、尿液等 5 尸體材料 死后應(yīng)盡早獲取，無菌采取，不使用防腐劑。 不同病毒所取材料不同，如NDV，取腦、氣管，

2、FMV取肺、PRRS取肺、SFV取淋巴結(jié)等。,二 標(biāo)本的保存和運送 盡量活體送檢，大部分病毒不穩(wěn)定，必須盡快送實驗室；如有延誤，則標(biāo)本必須冷藏，到實驗室立即處理和接種，延誤時間短的，可置4；時間延誤較長，置-70。 如郵寄標(biāo)本則需放置有干冰的保溫箱內(nèi)。 三 標(biāo)本處理 1 體液 可以直接接種、檢測 2血標(biāo)本 凝固血離心后的血清即可用于檢測 3各種拭子 4糞便標(biāo)本 5 組織材料,病原學(xué)檢測常用的實驗室技術(shù),分離培養(yǎng) （“金標(biāo)準(zhǔn)”） 形態(tài)學(xué)檢查 （病毒 電鏡鏡檢） 細(xì)菌的生化試驗 動物實驗 免疫學(xué)診斷技術(shù) ELISA IFA 免疫組化 分子生物學(xué)診斷技術(shù) PCR 熒光定量PCR,二、病料中細(xì)菌的檢測

3、方法,細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 細(xì)菌的生化試驗 動物試驗 血清學(xué)試驗 分子生物學(xué)方法,光學(xué)顯微鏡下細(xì)菌的形態(tài),細(xì)菌的形態(tài)觀察,光鏡和電鏡的比較,大腸桿菌,葡萄球菌,電鏡鏡檢,光學(xué)顯微鏡鏡檢,培養(yǎng)結(jié)果,初次分離,純培養(yǎng),鑒別培養(yǎng),不乳糖,發(fā)酵乳糖,麥康凱平板,不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌,大腸桿菌，呈現(xiàn)黑色金屬光澤,EMB平板,SS平板,大腸桿菌或者別的發(fā)酵乳糖的腸桿菌,有黑色中心的是沙門氏菌。如果沒有黑色中心，就很可能是志賀氏菌了。,不發(fā)酵乳糖的腸道菌，可能就是志賀氏菌。,不發(fā)酵乳糖的某種腸道菌，而且產(chǎn)生硫化氫，可能是沙門氏菌,發(fā)酵乳糖的某種腸桿菌。,HE（蘇木素伊紅)瓊脂平板,本培養(yǎng)基傾注平皿待

4、冷卻后呈草綠色，質(zhì)控菌株接種后。361培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果 。大腸桿菌部分被抑制，橙黃色-橙紅色。葡萄球菌生長被抑制。,革蘭氏染色,革蘭氏陽性,革蘭氏陰性,染色原理及過程： 初染（結(jié)晶紫） 媒染（碘液） 脫色（ 95酒精） 復(fù)染（復(fù)紅）,細(xì)菌的生化試驗,硫化氫試驗,糖發(fā)酵試驗,MR試驗,VP試驗,靛基質(zhì)試驗,藥敏試驗示意圖,涂布細(xì)菌,貼上藥敏紙片,1,2,溫箱培養(yǎng),3,4,以大腸桿菌為例：,剖檢（采集病料） 纖維素滲出物的涂片染色 分離培養(yǎng)（普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板或伊紅美蘭瓊脂平板） 培養(yǎng)物涂片G染色 生化試驗 動物試驗 血清學(xué)實驗 玻板凝集鑒定血清型,三、病料中病毒的檢測,病毒

5、分離和鑒定的一般程序,常用檢測方法,分離培養(yǎng) 血清學(xué) 中和試驗 補體結(jié)合試驗 血凝及血凝抑制試驗 免疫擴散試驗 免疫學(xué)診斷技術(shù) ELISA IFA 免疫組化 分子生物學(xué)檢測 PCR 分子雜交技術(shù),病毒分離,1動物接種,病毒的分離與鑒定,2雞胚培養(yǎng),3組織培養(yǎng),病毒中和試驗,本實驗極為特異和敏感，是病毒學(xué)中重要的血清學(xué)實驗。主要用于病毒感染的血清學(xué)診斷、病毒分離株的鑒定、不同病毒株的抗原關(guān)系研究、疫苗免疫原性的評價、免疫血清質(zhì)量的評價以及實驗動物中是否存在相應(yīng)的抗體等。,virus,補體結(jié)合反應(yīng),溶血 （-）,不溶血 （+）,免疫擴散,電鏡技術(shù),雞痘病毒（超薄切片）,狂犬病毒包涵體（Negri

6、body）,ELISA分類,ELISA Procedures,分子生物學(xué)方法,PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng)) 熒光實時定量PCR （real time PCR） NASBA （依賴核酸序列的擴增）,PCR原理:實質(zhì)就是體外基因復(fù)制技術(shù),加熱變性95 C,靶序列引物退火55 C,引物延伸72 C,原理圖示,一,二,三 完成一個循環(huán),30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824,1 cycl

7、e = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,熒光定量PCR Taqman 技術(shù),特異性熒光雙標(biāo)記探針 Taq酶 53外切酶活性,染料法的優(yōu)點：成本低不需要探針；適合初步篩查先用SYBR篩查，再用TaqMan精確定量部分關(guān)鍵樣品；融解曲線鑒定PCR有無雜帶、引物二聚體； 染料法的缺點：無模板特異性 不能分辨主帶與雜帶，給出的是總信號；不能做多重檢測 每孔只能檢測一個目標(biāo)基因；靈敏度低適合于5000 拷貝以上的基因定量。,