1、第五章 種子擴(kuò)大培養(yǎng),掌握工業(yè)發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝過程及操作要點 理解影響種子質(zhì)量的因素,學(xué)習(xí)目標(biāo),種子擴(kuò)大培養(yǎng)概念：,種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。,種子擴(kuò)大培養(yǎng)的原因,工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的增大,需要種子就增多,種子的擴(kuò)大培養(yǎng),種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)，不但要得到純而壯的培養(yǎng)物，還要獲得活力旺盛的、性能穩(wěn)定、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。,菌種擴(kuò)大培養(yǎng),（1）為發(fā)酵罐的投料提供足夠數(shù)量的代謝旺盛的種子。 （2）發(fā)酵時間的長短與接種量的大小有關(guān)，接種量大，發(fā)酵時間

2、則短。 （3）將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，就有利于縮短發(fā)酵時間，提高發(fā)酵罐的利用率，并且也有利于減少染菌的機(jī)會。 （4）對于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過程來說，必須根據(jù)菌種生長繁殖速度快慢及生產(chǎn)的規(guī)模決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級數(shù)。,種子質(zhì)量的優(yōu)劣對發(fā)酵生產(chǎn)起關(guān)鍵作用。其生產(chǎn)方法與條件隨不同的生產(chǎn)品種和菌種種類而異。,種子液(幾或幾十立方米),按10%接種量,發(fā)酵罐(幾十或幾百立方米),由實驗室制備到車間生產(chǎn) 的過程,作為種子的要求： 1)、菌種活力強(qiáng)，移種后能迅速生長，遲緩期短 2)、生理性狀穩(wěn)定 3)、菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求 4)、無雜菌污染 5)、保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力,第一節(jié) 種子制備工

3、藝,固體培養(yǎng)法 液體培養(yǎng)法(兩類）,操作步驟 培養(yǎng)設(shè)備 優(yōu)缺點,1、固體培養(yǎng)法,培養(yǎng)類型,2、液體培養(yǎng)法,靜置培養(yǎng),通氣培養(yǎng),厭氧發(fā)酵罐,搖瓶或種子罐,通氣量充足，溶氧好，菌體生長快，適合菌絲的種子制備,種子制備的過程大致可分為： 實驗室種子制備階段 生產(chǎn)車間種子制備階段,一、 實驗室種子制備,保藏在沙土管、冷凍干燥管或斜面上的菌種經(jīng)無菌操作接入適合于孢子發(fā)芽或者營養(yǎng)體生長的斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)成熟后挑選正常的孢子或營養(yǎng)菌體再一次接入試管斜面反復(fù)培養(yǎng)幾代。 這一階段也稱為活化，目的是使保藏的菌種達(dá)到正常穩(wěn)定的生長代謝速度。,斜面活化的菌種進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，根據(jù)菌種特性的不同可采用不同的培養(yǎng)方法。

4、,可采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，直接作為種子罐的種子。 舉例:產(chǎn)黃青霉菌，采用大米或小米為固體培養(yǎng)基，裝入搖瓶、滅菌，要注意控制米粒含水量，使米粒不粘不散。接入孢子，25-28培養(yǎng)14d。培養(yǎng)結(jié)束，將孢子瓶于真空下抽去水分，使含水量10以下，冰箱保存?zhèn)溆谩?產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種,生產(chǎn)上一般采用斜面營養(yǎng)細(xì)胞保藏法。 通過實驗室種子擴(kuò)培獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體。 斜面菌種于32，培養(yǎng)18-24h，即可移入250mL搖瓶液體培養(yǎng)基，32培養(yǎng)12h，即可作種子罐種子。 例如：谷氨酸棒狀桿菌。,不產(chǎn)孢子的菌種,一般保存在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基或MYPG培養(yǎng)基的斜面上，4冰箱保存.每年移種3-

5、4次。 斜面菌種接入含10mL麥芽汁試管25-27培養(yǎng)2-3d擴(kuò)大至三角瓶25培養(yǎng)2d移至含5-10L麥芽汁的罐15-20培養(yǎng)3-5d含100L麥芽汁的發(fā)酵罐。,生產(chǎn)啤酒的酵母菌,MYPG培養(yǎng)基：3g麥芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨, 10g葡萄糖,20g瓊脂,1L水。,除蛋白質(zhì)、鹽類、維生素外能溶于水的浸出物質(zhì)，包括含氮浸出物和無氮浸出物。,二、生產(chǎn)車間種子制備,采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米槳、磷酸鹽等，同時還需供給足夠的無菌空氣并不斷攪拌，使菌絲體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。,種子罐培養(yǎng)原則：,以實驗室制備的孢子或搖瓶營養(yǎng)細(xì)胞做種子，經(jīng)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)后，滿足發(fā)酵罐

6、對種子的要求。,搖瓶菌絲體種子： 種子罐之間或發(fā)酵罐間的移種：,接種方法：,可在火焰保護(hù)下接入種子罐或采用壓差法接入。,主要采用壓差法，由種子接種管道進(jìn)行移種，移種過程中要防止接受罐表壓降至零.,種子罐級數(shù)的確定,種子罐級數(shù)指制備種子需擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù).,種子罐的作用？,種子制備的工藝過程中，因菌種不同，一般可以分為一級種子、二級種子和三級種子。,種子罐的級數(shù)主要取決于菌種的性質(zhì)、菌體生長速度、產(chǎn)物品種、生產(chǎn)規(guī)模及發(fā)酵設(shè)備的合理利用率。,一級種子接入發(fā)酵罐發(fā)酵稱為二級發(fā)酵 二級種子接入發(fā)酵罐發(fā)酵稱為三級發(fā)酵 。 依次類推 可知發(fā)酵的級數(shù)=種子級數(shù)+1,種子罐級數(shù)的意義： 種子罐級數(shù)越少，越有利于

7、簡化工藝和控制，并可減少移種帶來染菌機(jī)會。 但也必須考慮盡量延長發(fā)酵罐生產(chǎn)產(chǎn)物的時間，縮短由于種子發(fā)芽、生長而占用的非生產(chǎn)時間，以提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。因此，種子罐級數(shù)不宜過少。,一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備,制備過程,斜面菌種,一級種子培養(yǎng),二級種子培養(yǎng),發(fā)酵,1、斜面培養(yǎng),培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化鈉 0.5 瓊脂 2%， pH 7.07.2。,培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細(xì),培養(yǎng)條件：32，生長1824h。,生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次。,2. 一級種子（搖瓶）,培養(yǎng)條件：于1000mL三角瓶中，裝液200 250mL，32培養(yǎng)12h。,培養(yǎng)基：

8、葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿 2.5 K2HPO4 0.1%。,培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。,培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的 1%），32培養(yǎng)710h。,培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解 糖代替，濃度為2.5%。,培養(yǎng)基的特點：菌體生長，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。,3、二級種子（種子罐）,108109cfu/mL。（菌數(shù)） 大小均勻，呈單個或八字排列。（菌體） pH 7.07.2時結(jié)束。（性能） 活力旺盛。（活力）,種子的質(zhì)量要求：,二、青霉素生產(chǎn)的種子制備,制備過程：,安瓿管, 斜面孢子, 大米孢子, 一級種子, 二級種子, 發(fā)酵,培養(yǎng)

9、基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等。,培養(yǎng)基特點：有利于長孢子，用量少而精細(xì)。,培養(yǎng)條件：25、7d，注意濕度50%左右。,1、斜面孢子,培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）。,培養(yǎng)基的特點：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，營養(yǎng)適當(dāng)（要求大米的白點?。┯欣阪咦拥纳L。,培養(yǎng)條件：25、7d，控制濕度。,大米孢子的要求：1粒米含1.4106個孢子。,2、大米孢子,3、一級種子,培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿。,目的：菌體生長。,培養(yǎng)條件：27，40h。,接種量：200億孢子/t。,4、二級種子,培養(yǎng)基：同上,培養(yǎng)條件：27、1014h。,接種量：10%。,種子的質(zhì)量要求,菌絲長稠呈

10、絲狀、菌絲團(tuán)很少，有中小空孢，處于期。,青霉素發(fā)酵菌絲體的生長共分為6個期，14為年青期，46期合成青霉素的能力最強(qiáng)。,種子制備方法 實驗室種子制備工藝 生產(chǎn)車間種子制備工藝,復(fù)習(xí)上一課內(nèi)容,種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 種子質(zhì)量判斷方法 影響孢子質(zhì)量的因素 影響種子質(zhì)量的因素,第三節(jié) 影響種子質(zhì)量的因素,培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件 種齡 接種量,影響種子質(zhì)量的因素,生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。 營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要 營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近,1.培養(yǎng)基,溫度 溶解氧 一般前期需氧量少，后期需氧量較多。 逐級的接近發(fā)酵培養(yǎng)的條件,2.培養(yǎng)條件,種齡是指種子罐中培養(yǎng)的

11、菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。 通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達(dá)到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。 不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。,3.種齡,接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。 通常接種量，細(xì)菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有時2025%,4、接種量,接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度。,采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機(jī)會。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。,A 菌種穩(wěn)定性的檢查 生產(chǎn)菌種，必須保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力，雖然菌種保藏在休眠狀態(tài)的環(huán)境中，但微生物或多或少