1、第四章 蛋白質(zhì)化學(xué),北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院中藥系,本章知識要點,掌握氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類和性質(zhì) 掌握蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì) 熟悉維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作用力 了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及體內(nèi)重要的活性肽,難點：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),目 錄,第一節(jié) 蛋白質(zhì)的分子組成 第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),蛋白質(zhì)化學(xué),蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性,1. 蛋白質(zhì)是生物 體重要組成成分 分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。 含量高：蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的45，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80。,作為生物

2、催化劑（酶） 代謝調(diào)節(jié)作用 免疫保護作用 物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲 運動與支持作用 參與細胞間信息傳遞,蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能,氧化供能,蛋 白 質(zhì) 的 分 子 組 成The Molecular Component of Protein,第 一 節(jié),一、元素組成,1、主要元素：C、H、O、N和S，有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘 。 2、特點：各種蛋白質(zhì)的含量很接近，平均含氮量約為16%。 3、定氮法測定蛋白質(zhì)含量： 蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含N量6.25,二、結(jié)構(gòu)單位-氨基酸,存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種(20-22)，且均

3、屬 L-氨基酸（甘氨酸除外）如圖示。,1、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位,R,L-氨基酸的通式,CH3,丙氨酸,H,甘氨酸,C H,COOH,R,R:H 甘AA; R:CH3 丙AA R:CH-OH 蘇AA CH3,H2N,三、氨基酸的分類,據(jù)R基團化學(xué)結(jié)構(gòu)分類,脂肪族A（中性、含羥基或巰基、酸性、堿性）,芳香族A(Phe、Tyr、Trp),雜環(huán)(His、Pro),據(jù)R基團極性分類,極性R基團AA,非極性R基團AA（種）,不帶電荷（種）,帶電荷：正電荷（種）負電荷（種）,據(jù)氨基、羧基數(shù)分類,一氨基一羧基,一氨基二羧基(Glu、Asp),二氨基一羧基(Lys、His、Arg),人的必需氨基酸 LysTrpPh

4、eValMetLeuIleThr Arg、His,1.非極性疏水R基氨基酸,2. 極性中性R基氨基酸,3. 帶正電荷R基氨基酸（堿性氨基酸）,4. 帶負電荷R基氨基酸（酸性氨基酸）,幾種特殊氨基酸,脯氨酸 （亞氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,小結(jié),蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位：L氨基酸 氨基酸：脯氨酸（亞氨基酸）除外 L氨基酸：甘氨酸（無不對稱C）除外 氨基酸的結(jié)構(gòu)通式：RCH(NH2)COOH 常見的氨基酸種類：20種,氨基酸的分類：按其側(cè)鏈R基團結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分類： 非極性、疏水氨基酸（非極性R基氨基酸） Val,Leu,ile（支鏈）；Gly(無旋光異構(gòu)）；Met（含 硫）；Phe（芳香族）；Pr

5、o（亞氨酸） 極性、中性氨基酸（不帶電荷的極性R基氨基酸）： Ser,Thr（含羥基）；Tyr,Trp（芳香族）；Cys（含硫）；Gln,Asn（含?；?酸性氨基酸（含有兩個羧基）： Glu（含羧基）；Asp（含羧基） 堿性氨基酸（含有兩個以上氨基）： Arg（胍基）；His（咪唑基）；Lys（氨基） 含硫氨基酸：Met、Cys 芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp,四、氨基酸的性質(zhì),（1）物理性質(zhì) （2）兩性解離和等電點 （3）紫外吸收特征 （4）茚三酮反應(yīng),氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點,pH = pI 氨基酸的兼性離子,pH pI 陽離子,pH pI 陰離子,(pK1),(pK2),當(dāng)氨

6、基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(isoelectric point，pI)。,氨基酸等電點的計算,pI值等于aa的兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團pK值之和的二分之一,（3）紫外吸收： Trp、Tyr和Phe 在280nm波長附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm。,摩爾吸收系數(shù),波長,氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸含量存在正比關(guān)系，因此可以作為氨基酸定量分析方法。 例外：脯氨酸黃色；天冬酰胺棕色,（4）

7、顯色反應(yīng)-茚三酮反應(yīng),氨基酸與茚三酮反應(yīng),+,水合茚三酮(無色),藍紫色化合物,水合茚三酮,五、蛋白質(zhì)分類,按照組成分類,根據(jù)構(gòu)象分類,單純蛋白：只有氨基酸組分,綴合蛋白：氨基酸組分+其他組分（輔基）脂蛋白、糖蛋白、核蛋白和金屬蛋白等,纖維蛋白質(zhì),球狀蛋白質(zhì),按生物功能分類,酶、調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、運動蛋白,防御蛋白、營養(yǎng)蛋白、儲存蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、毒蛋白等,蛋 白 質(zhì) 的 分 子 結(jié) 構(gòu)The Molecular Structure of Protein,第 二 節(jié),一、蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)形式,1、連接方式：肽鍵 肽鍵（peptide bond）：一個氨基酸的羧基與另一氨基酸的氨基縮水而成的酰胺

8、鍵稱為肽鍵。（CONH） 肽平面（peptide unit）：由肽鍵中的四個原子和與之相鄰的兩個碳原子共同構(gòu)成的剛性平面。 （CCONHC）,肽和肽鍵的形成,肽單位,肽鍵,* 肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,* 兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽,* 肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。,* 由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。,2、肽的分類和命名,3、幾種生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),GSH過氧化物酶

9、,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,GSSG：氧化性谷胱甘肽,體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽,神經(jīng)肽(neuropeptide),多肽類激素及活性肽,抗利尿素與催產(chǎn)素(9肽)、胰高血糖素（29肽）、腦啡肽（5肽）、 降鈣素（32肽）、 ACTH（39肽）、胰島素（51肽）肌肽（2肽）、 P物質(zhì)（10肽、屬神經(jīng)肽類）、內(nèi)啡肽（31肽）,一級結(jié)構(gòu)(primary structure) 二級結(jié)構(gòu)(secondary structure) 三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure) 四級結(jié)構(gòu)(quaternary structure),4、蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)形式： 多肽鏈（NHCHCONHCH

10、CO） 多肽鏈的方向性：從N末端指向C末端。,高級 結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要層次,一級結(jié)構(gòu),四級結(jié)構(gòu),二級結(jié)構(gòu),三級結(jié)構(gòu),primary structure,secondary structure,Tertiary structure,quariernary structure,二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) (primary structure),一級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)的多肽鏈中氨基酸的排列順序。包括二硫鍵的位置。主要靠肽鍵維系。 二四級結(jié)構(gòu)稱為蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，或空間構(gòu)象；主要靠次級鍵維系，尤其是疏水鍵。,一級結(jié)構(gòu)體現(xiàn)生物信息：20n多樣 一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)及生物活性的基礎(chǔ)特異 一級結(jié)構(gòu)的連接鍵：肽鍵（主

11、要）、二硫鍵,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu),一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。它由遺傳密碼決定，其上有酶切位點，一級結(jié)構(gòu)可測定，并不同種屬間有同源性。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,研究蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的意義,蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是其生物活性的分子基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是其構(gòu)象的基礎(chǔ)，包含了形成特定構(gòu)象所需的全部信息。 眾多遺傳性疾病的分子基礎(chǔ)是基因突變導(dǎo)致其所表達的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生變異。 研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)可闡明生物進化史，不同物種的同源蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)越相似，物種之間的進化關(guān)系越近。,三、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),螺旋（helix） 折疊（-pleated sheet） 轉(zhuǎn)角（-turn） 無規(guī)

12、則卷曲（nonregular coil）,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（secondary structure）指肽鏈主鏈不同區(qū)段通過自身的相互作用，形成氫鍵，沿某一主軸盤旋折疊而形成的局部空間結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象單元主要有以下類型：,參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面， C1和C2在平面上所處的位置為反式（trans）構(gòu)型，此同一平面上的6個原子構(gòu)成了所謂的肽單元 (peptide unit) 。,肽單元,肽鏈與肽平面,特征：1、 每隔3.6個AA殘基螺旋上升一圈，螺距0.54nm; 2 、 螺旋體中所有氨基酸殘基R側(cè)鏈都伸向外側(cè)，鏈中的全部C=0 和N-H幾乎都平行于螺旋軸;

13、 3、每個氨基酸殘基的N-H與前面第四個氨基酸殘基的C=0形成氫鍵，肽鏈上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成。,螺旋（helix）,形成因素：與組成和排列順序直接相關(guān)。 多態(tài)性：多數(shù)為右手（較穩(wěn)定），亦有少數(shù)左手螺旋存在（不穩(wěn)定）；存在尺寸不同的螺旋。,折疊（-pleated sheet）,特征：兩條或多條伸展的多肽鏈（或一條多肽鏈的若干肽段）側(cè)向集聚，通過相鄰肽鏈主鏈上的N-H與C=O之間有規(guī)則的氫鍵，形成鋸齒狀片層結(jié)構(gòu)，即折疊片。 類別：平行 反平行,-折疊,-折疊,轉(zhuǎn)角（-turn）,特征：多肽鏈中氨基酸殘基n的羰基上的氧與殘基（n+3）的氮原上的氫之間形成氫鍵，肽鍵回折1800 。,無規(guī)則卷曲

14、示意圖,無規(guī)則卷曲,細胞色素C的三級結(jié)構(gòu),四、 蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域,(2) 結(jié)構(gòu)域（structure domain）,蛋白質(zhì)中相鄰的二級結(jié)構(gòu)單位（即單個螺旋或折疊或轉(zhuǎn)角）組合在一起，形成有規(guī)則的、在空間上能辯認的二級結(jié)構(gòu)組合體稱為蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu) 基本組合方式：；,在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽進一步卷曲折疊成幾個相對獨立、近似球形的三維實體，再由兩個或兩個以上這樣的三維實體締合成三級結(jié)構(gòu)，這種相對獨立的三維實體稱為結(jié)構(gòu)域。 形成意義： 動力學(xué)上更為合理 蛋白質(zhì)（酶）活性部位往往位于結(jié)構(gòu)域之間，使其更具柔性,()超二級結(jié)構(gòu)（ supersecondary structure ）-基序或摸

15、體,超二級結(jié)構(gòu)類型,-鏈,回形拓撲結(jié)構(gòu), -迂回,卵溶菌酶的三級結(jié)構(gòu)中的兩個結(jié)構(gòu)域,-螺旋,-轉(zhuǎn)角,-折疊,二硫鍵,結(jié)構(gòu)域1,結(jié)構(gòu)域2,平行-折疊的結(jié)構(gòu)比較（a） -園桶形排布，（b）馬蹄形排布,五、三級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是指在一條多肽鏈中所有原子的整體空間排布，包括主鏈和側(cè)鏈。三級結(jié)構(gòu)的形成使得在序列中相隔較遠的氨基酸側(cè)鏈相互靠近。,長度縮短：球形、橢球形、桿狀，等 多數(shù)含有-螺旋和-折疊 氨基酸位置由側(cè)鏈極性決定：非極性（內(nèi)）、極性（表面，少數(shù)內(nèi)部）、帶電（表面） 次級鍵維系：疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華力、二硫鍵 功能區(qū)：表面或特定部位,肌紅蛋白為單肽鏈蛋白質(zhì)，含153個氨基酸殘基，它

16、含有8個螺旋區(qū)，依次稱為A到H螺旋，并含有轉(zhuǎn)角及環(huán)-卷曲等二級結(jié)構(gòu)。,六、四級結(jié)構(gòu),許多蛋白質(zhì)是由兩個或兩個以上獨立的三級結(jié)構(gòu)通過非共價鍵結(jié)合成的多聚體，稱為寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每個獨立三級結(jié)構(gòu)單元稱為亞基。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)是指亞基的種類、數(shù)量以及各個亞基在寡聚蛋白質(zhì)中的空間排布和亞基間的相互作用。,亞基：具有獨立的一、二、三級結(jié)構(gòu)，單獨存在時一般無 生物學(xué)活性。亞基之間以非共價鍵聯(lián)系 亞基之間以非共價鍵聯(lián)系：包括疏水鍵（主要）、鹽鍵、 氫鍵、范德華力 亞基可以相同或不同,血紅蛋白四級結(jié)構(gòu),煙草花葉病毒外殼蛋白四級結(jié)構(gòu)的自我組裝,七、維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵,七、維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵,肽鍵,

17、1.二硫鍵 disulfide bond,燙 發(fā),西佛堿結(jié)構(gòu) schiffs base,2、氫鍵 hydrogen bond,3、疏水作用 hydrophobic interaction,4、離子鍵 ionic bond,5、范德華力 Van der Waals interaction,何為堿性氨基酸？包括哪些？ 何為酸性氨基酸？包括哪些？ 何為芳香族氨基酸？包括哪些？ 什么是氨基酸的兩性電離？ 什么是氨基酸的等電點？,復(fù)習(xí)思考題,第三節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,(一)、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 (二)、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,1、一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)，決定其構(gòu)象,(一)、蛋白質(zhì)

18、一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,牛胰核糖核酸酶的變性與復(fù)性,不同種屬來源的一些蛋白質(zhì)的氨基酸序列非常相似，構(gòu)象也相似，功能也相也一致，這些蛋白質(zhì)成為同源蛋白質(zhì) 同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的這種相似稱為序列同源現(xiàn)象 在同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，有許多位置的氨基酸是相同的，這些氨基酸成為不變殘基 不變殘基大多是維持蛋白質(zhì)構(gòu)象和活性所必須的氨基酸 相比之下，其他位置的氨基酸差異較大，這些氨基酸稱為可變氨基,2、同源蛋白質(zhì)存在序列同源現(xiàn)象,2、同源蛋白質(zhì)存在序列同源現(xiàn)象,S S,S S,S S,N,N,A鏈、21AA,B鏈、30AA,胰島 素 A8 A9 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 豬 Thr

19、 Ser Ile Ala,3、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)可直接影響其功能,蛋白質(zhì)分子中起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基缺失或被替代，將嚴重影響空間構(gòu)象乃至生理功能。,例子：鐮刀狀紅細胞貧血,這種由基因突變造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或合成量異常而導(dǎo)致的疾病稱為“分子病”。,3、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)可直接影響其功能,例：鐮刀形紅細胞貧血,（谷氨酸）,（纈氨酸）,這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。,(二)、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,1、蛋白質(zhì)構(gòu)象不同，理化性質(zhì)不同，更能各異,纖維狀蛋白質(zhì)是動物體的支架和外保護成分，其二級結(jié)構(gòu)比較單一，如指甲和毛發(fā)的主要成分是角蛋白（-keratin）。 角蛋白由大量二級結(jié)構(gòu)為螺旋

20、的肽鏈經(jīng)過多級纏繞形成，堅韌而富有彈性，這與其保護功能一致（如上圖）,球狀蛋白質(zhì)主要是酶和調(diào)控蛋白，其構(gòu)象中包含各種二級結(jié)構(gòu)，由它們形成的結(jié)構(gòu)與常常是酶的活性中心，或者是調(diào)控蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合位點。,2、變構(gòu)效應(yīng),蛋白質(zhì)分子與它的配體結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化，其功能也隨之變化的現(xiàn)象，稱為變構(gòu)效應(yīng),血紅蛋白是變構(gòu)蛋白，O2結(jié)合到一個亞基上以后，影響與其它亞基的相互作用,血紅蛋白結(jié)合氧前后構(gòu)象的變化,當(dāng)血紅蛋白結(jié)合氧以后，11與22兩個二聚體彼此滑動15，其構(gòu)象由T（tense）型轉(zhuǎn)變?yōu)镽（relaxed）型。,蛋白質(zhì)構(gòu)象病,若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)

21、象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時會導(dǎo)致疾病發(fā)生,朊病毒：是一類只有蛋白質(zhì)而沒有核酸的病原體,舉例：,瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。 正常的PrP富含-螺旋，稱為PrPc。 PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為-折疊的PrPsc，從而致病。,瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變,第四節(jié),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) The Physical and Chemical Characters of Protein,一、一般性質(zhì),1、紫外吸收特征,由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其

22、濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。（與Trp Tyr有關(guān)）,分光光度計比色,蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。,* 蛋白質(zhì)的等電點( isoelectric point, pI) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。,一、蛋白質(zhì)兩性解離和等電點,Pr,COOH,NH3+,OH-,H+,Pr,NH3+,COO-,OH-,Pr,H+,NH2,COO,-,正離子 pH pI,兩性離子 pHpI,負離子 pH pI,蛋白質(zhì)含

23、堿性氨基酸越多其等電點越高 蛋白質(zhì)含疏水氨基酸越多其溶解度越小,蛋白質(zhì)等電點,Protein pI Pepsin 1.0 Serum albumin 4.9 Urease 5.0 Hemoglobin 6.8 Myoglobin 7.0 Chymotrypsinogen 9.5 Lysozyme 11.0,3、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng),a茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction),b雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction) 雙縮脲由兩分子尿素脫氨縮合生成，在堿性溶液中與Cu2+作用呈紫紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。,C酚試劑反應(yīng) 酚試劑含有磷鉬酸-磷鎢酸，與蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)比較復(fù)雜：（1）在

24、堿性條件下，蛋白質(zhì)與Cu2+作用生成螯合物。（2）酪氨酸的酚基在堿性條件下將磷鉬酸-磷鎢酸試劑還原，呈深藍色磷鉬藍和磷鎢藍混合物,二、大分子特性,1、 半透膜與透析,透 析,2、沉降與沉降系數(shù),3、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體,* 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素 顆粒表面電荷（非等電點） 水化膜（球狀蛋白-親水基團）,水化膜,溶液中蛋白質(zhì)的聚合沉淀,4、沉淀,能破壞蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定因素的方法都可以使蛋白質(zhì)分子使蛋白質(zhì)分子聚集成顆粒并沉淀 常用的沉淀方法：a鹽析b重金屬離子沉淀c生物堿試劑以及

25、某些酸類沉淀d有機溶劑沉淀 科研工作中常把沉淀作為分離提純蛋白質(zhì)的一種手段,4、沉淀,蛋白質(zhì)沉淀：蛋白質(zhì)分子從溶液中析出的現(xiàn)象,a 鹽析,在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強電解質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析,鹽析的機理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷,鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變形。,b 重金屬鹽沉淀,條件：pH稍大于pI為宜。在蛋白質(zhì)溶液中加入重金屬鹽溶液，會使蛋白質(zhì)沉淀,重金屬沉淀法的機理：重金屬鹽加入之后，與帶負電的羧基結(jié)合,c 生物堿試劑沉淀法,條件：pH稍小于pI,生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機理：在酸性條件下，

26、蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀,d 有機溶劑沉淀法,在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。,有機溶劑沉淀發(fā)的機理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜,有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進行，否則有機溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性,5、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性,* 蛋白質(zhì)的變性(denaturation) 在某些物理和化學(xué)因素作用下，蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。,引起變性的因素:物理和化學(xué)因素 物理因素：高溫、高壓、振蕩、紫外線、超聲波、加熱等 化學(xué)因素：強酸、強堿、乙醇、丙

27、酮、尿素、重金屬離子和去污劑（如十二烷基硫酸鈉）等 。,蛋白質(zhì)變性的特點,蛋白質(zhì)變性的結(jié)果是有些原來在分子內(nèi)部的疏水基團暴露出來，從而使得蛋白質(zhì)分子：,不對稱性增加 黏度增加 擴散系數(shù)減小 溶解度降低 結(jié)晶性喪失 生物活性喪失 容易被蛋白酶降解,臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。 此外, 防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。,應(yīng)用舉例,蛋白質(zhì)凝固,將pH值接近等電點的蛋白質(zhì)溶液加熱，可以使蛋白質(zhì)形成較堅固的凝塊，該凝塊不溶于強堿或強酸，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)凝固。,示例：雞蛋煮熟后蛋清形成凝塊,凝固本質(zhì)是蛋白質(zhì)變性后進一步發(fā)展的不可逆結(jié)果,有些蛋白質(zhì)的變性是可逆的。

28、當(dāng)變性程度較輕時，如果除去變性因素，蛋白質(zhì)仍能恢復(fù)或部分恢復(fù)其原來的構(gòu)象及功能，這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。,蛋白質(zhì)復(fù)性,示例：核糖核酸酶,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 -巰基乙醇,去除尿素、 -巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,蛋白質(zhì)變性、沉淀和凝固之間的關(guān)系,蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致構(gòu)象破壞，活性喪失，但不一定沉淀 蛋白質(zhì)沉淀是膠體溶液穩(wěn)定因素被破壞的結(jié)果，構(gòu)象不一定改變，活性也不一定喪失，所以不一定變性 蛋白質(zhì)凝固是變性的特殊類型，是變性蛋白質(zhì)進一步形成較固定的凝塊,A、蛋白質(zhì)的分離和純化,（一）透析及超濾法,* 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。,* 超濾法 應(yīng)

29、用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。,生物化學(xué)技術(shù)：,&.透析,（二）免疫沉淀,* 免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。,binding,wash,elution,免 疫 沉 淀,抗體,Protein A-agarose,（三）電泳,蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳(elctrophoresis) 。 根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,幾種重要的蛋白質(zhì)電泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。 *等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 *雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,（四）層 析,