1、HPLC,高效液相色譜,基本原理 加樣 流動相 流動相 A C B B C A 固定相 柱內(nèi)填料，流動相 洗脫劑。 HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的不同，進行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達到分離的過程。,基本操作,1.打開泵電源，待自檢完成后打開“Purge”閥進行排液以除去泵頭之前的氣泡，排氣完成后關(guān)閉“Purge”閥。按“Pump”鍵開啟泵，然后按“func”及數(shù)字鍵以0.2ml/min的速度慢慢將流速調(diào)1.0ml/min （其中測甘油果糖氯化鈉注射液時應(yīng)以0.1ml/min的速度慢慢將流速調(diào)0.5ml/min ）。 2.一般柱平衡時間為30min左右（測甘油果糖氯化

2、鈉注射液時平衡時間會更長些），此時依次打開檢測器、工作站電源，打開計算機中工作站，待儀器自檢連接完成后查看基線，如基線平穩(wěn)即可進樣采集數(shù)據(jù)。 3.檢測完成后，關(guān)閉計算機中工作站、檢測器、工作站電源，將泵的流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”鍵關(guān)閉泵，將流動相換至10%甲醇水或乙腈水，再以1.0ml/min流速沖洗色譜柱30-60min。 4.最后將色譜柱充滿純甲醇保存。 5.手動進樣器使用后，用適當(dāng)溶劑沖洗進樣閥，除去殘留的樣品，溶劑，緩沖鹽等，蓋好封蓋防止灰塵顆粒。,流動相的配制 配制用水最好用蒸餾水（注射水） 稱量、量取、調(diào)pH時盡可能精確 流動相必須用0.45um濾膜過濾，注意

3、區(qū)分有機膜、無機膜 加入甲醇或乙腈后要混合充分 流動相必須經(jīng)過脫氣（常用方法是超聲脫氣） 配制所用的試劑盡可能用色譜純，如沒有色譜純可用分析純代替 流動相應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配制，染菌的流動相禁止使用 配制過程中應(yīng)注意自我保護,流動相使用前為什么要脫氣？,流動相使用前必須進行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。 常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法 加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。 抽

4、真空脫氣法：易抽走有機相。 超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中用超聲波振蕩，超聲過程中觀察無氣泡生成即可。 在線真空脫氣法：真空脫機利用膜滲透技術(shù)在線脫氣，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。,色譜柱的良好使用規(guī)范,溶劑使用前必須過濾 運輸中變干了的色譜柱要完全浸濕（預(yù)處理） 如果樣品中含有無需考慮而保留強的組分時,必須進行前處理 清楚了解色譜柱填料適用的pH范圍(3-7)，溫度(60),化學(xué)適應(yīng)性 使用新鮮的水溶液,流動相現(xiàn)用現(xiàn)配制 定期用強極性溶劑沖洗色譜柱 儲存色譜柱時,要將緩沖液沖洗干凈,并保存在適合的溶劑中,如甲醇、乙腈 避免操作不當(dāng)損壞色譜柱,

5、如:猛敲,跌落或過緊擰接頭,最常用的“萬能柱”填料為“C18”，簡稱“ODS”柱，即十八烷基硅烷鍵 合硅膠填料（Octadecylsilyl，簡稱ODS）。這種填料在反相色譜中發(fā)揮 著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜7080的分析任務(wù)。 由于C18(ODS)是長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對 各種類型的生物大分子有更強的適應(yīng)能力，因此在生物化學(xué)分析工作中應(yīng) 用的最為廣泛。 按鍵合到基質(zhì)上的官能團可分為： 反相柱：填料為非極性，官能團為烷烴，例如：C18(ODS)、C8、C4等。 正相柱：填料為極性，官能團為 CN氰基、NH2氨基等。 離子交換鍵合相： 陽離子官能團：SO3H

6、磺酸基、COOH羧基等。 陰離子官能團：R4N季銨基、-氨基等。 （由于硅膠基質(zhì)的鍵合相只能在pH27.5的范圍內(nèi)使用，而離子交換色譜要求有更寬的pH范圍，因此其基質(zhì)現(xiàn)在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯）,色譜柱的故障診斷- 基線噪音,可能的原因: 1、流動相脫氣不徹底 2、檢測器流通池污染或有氣泡 3、檢測器光源能量不穩(wěn) 4、周期性噪音可能由泵的脈動引起 5、電子放大電路不穩(wěn)定,色譜柱故障診斷-基線漂移,可能的原因 梯度洗脫 流動相不干凈 溫度波動(對示差折光檢測器影響更大) 流動相與色譜柱未達到平衡 系統(tǒng)中污染物流失 電子線路不穩(wěn)定 檢測器預(yù)熱時間不夠 進樣器中殘留，硬件與流動相不相容，如Pe

7、ek材料與不合適的有機溶劑合用,色譜柱故障診斷-鬼峰,鬼峰 -是指在未進樣時也能出現(xiàn)的色譜峰 原因：1、流動相不干凈，尤其是弱極性流動相， RPC中水的純度比甲醇影響更大； 2、樣品的交叉污染,色譜柱故障診斷- 峰形問題,可能的原因： 1、色譜柱柱床塌陷，出現(xiàn)死體積 2、過濾片部分堵塞 3、兩個組分共同流出，形成一個峰(DAD) 4、樣品溶劑不匹配,色譜柱故障診斷-峰形問題,所有的峰都變寬 1.柱效降低，柱床塌陷 2.進樣體積（質(zhì)量）過大 3.流動相黏度太大 4.樣品溶劑與流動相不匹配 有些峰變寬 1.上一次進樣時未洗脫出來的峰 2.樣品分子量太大，如蛋白質(zhì)或聚合物反應(yīng)峰,色譜柱故障診斷- 峰

8、形問題,可能的原因 有些峰拖尾 1、二次保留效應(yīng)，殘留的硅羥基影響 2、在大峰的尾部有小峰流出（DAD） 所有的峰都拖尾 1、柱外效應(yīng) 2、金屬離子影響（酸洗） 3、樣品過載或溶劑不合適 4、柱頭交叉污染或柱已損壞,拖尾峰對稱因子1.2,色譜柱故障診斷- 峰形問題,可能的原因 1.小峰在大峰前流出 2.柱床塌陷 3.樣品溶劑不合適 4.柱過濾片部分堵塞 5.柱過載，偶爾發(fā)生,手動進樣器的使用、維護,樣品溶液進樣前必須用0.45um濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損 轉(zhuǎn)動切換時不能太慢，更不能停留在中間 位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增， 甚至超過泵的最大壓力 避免使用針頭彎曲，毛刺，變鈍的

9、進樣針 使用后，用適當(dāng)溶劑沖洗進樣閥，除去殘 留的樣品，溶劑，緩沖鹽等，蓋好封蓋防 止灰塵顆粒 必要時更換轉(zhuǎn)子密封墊,系統(tǒng)適應(yīng)性試驗,1.色譜柱的理論板數(shù) * 2.分離度 * 3.重復(fù)性 4.拖尾因子,色譜柱的理論塔板數(shù)（n）,用于評價色譜柱的分離效能。 n=16(tR/w)2 或n=5.54(tR/wh/2)2計算色譜柱的理論板數(shù)。 保留時間tR 峰寬w 半高峰寬wh/2,分離度（R）,用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程序，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標。 除另有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。 計算公式 或,重復(fù)性,用于評價連續(xù)進樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的

10、重復(fù)性能。 采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%。 相對標準偏差 RSD 采用內(nèi)標法時，其相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%。,拖尾因子（T）,用于評價色譜柱的對稱性。 為保證分離效果和測量精度，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規(guī)定。 拖尾因子計算公式為 。 除另有規(guī)定外，峰高法定量時T應(yīng)在0.95 1.05之間。 峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的準確測量。,系統(tǒng)適應(yīng)性試驗1.理論塔板數(shù) n2.分離度 （R 1.5）3.重復(fù)性 RSD=0.1%4.拖尾因子 T=1.04,替硝唑含量,理論塔板數(shù)=154

11、87 對稱因子=1.05,含量測定-內(nèi)標法,按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成規(guī)定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子： 校正因子（f）ASCS/ARCR 式中： AS為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高；AR為對照品的峰面積或峰高；CS為內(nèi)標物質(zhì)的濃度，CR為對照品的濃度。 再取各品種項下含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量： 含量（ cX ） fAxC/S /As 式中： AX為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積

12、或峰高；CX為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度；A/S為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高；C/S為內(nèi)標物質(zhì)的濃度；f為校正因子。 采用內(nèi)標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測量結(jié)果的影響。,含量測定-外標法,按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密量取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測組分的峰面積（或峰高），按下式計算含量： 含量（CX）cR Ax /AR 式中各符號意義同上。 由于微量注射器不易精確控制進樣量，當(dāng)采用外標法測定供試品中成分或雜質(zhì)含量時，以定量環(huán)或自動進樣器進樣為好。,替硝唑有關(guān)物質(zhì),其中雜質(zhì)與2-甲基-5硝基咪唑的分離度為1.69,

13、有關(guān)物質(zhì),1.加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對照品和待測組分對照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述內(nèi)標法計算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。這些需作校正計算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。 測定雜質(zhì)含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤海M樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜

14、峰的峰高約達滿量程的10%25%或其峰面積能準確積分通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對標準偏差（RSD）應(yīng)小于10%；含量在0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2.0%。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜峰上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質(zhì)含量。,2.不加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質(zhì)含量時，若沒有雜質(zhì)對照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照品溶液并調(diào)節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對照品溶液主成分的峰面積比較，計算雜質(zhì)含量。 若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供