1、離子交換色譜,運(yùn)用與分析,主講：許先融 編輯： 資料搜集：劉佳娜 李春鳳 甘權(quán)賢 資料整理：李揚(yáng)帆 劉雁 08中藥分析與鑒定（1）班,基本原理：,離子交換色譜 （ion exchange chromatography，IEC） 以離子交換樹(shù)脂作為固定相，樹(shù)脂上具有固定離子基團(tuán)及可交換的離子基團(tuán)。當(dāng)流動(dòng)相帶著組分電離生成的離子通過(guò)固定相時(shí)，組分離子與樹(shù)脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆變換。根據(jù)組分離子對(duì)樹(shù)脂親合力不同而得到分離。,2,學(xué)習(xí)交流PPT,主要用于分離離子或可離解的化合物，包括氨基酸，多肽，核酸，核苷等各種生物大分子。,離子交換色譜的運(yùn)用：,3,學(xué)習(xí)交流PPT,分離純化生物大分子,Po+Z

2、Do=Pb+ZDb,重視,Po:流動(dòng)相中溶質(zhì)的濃度； Pb:填料表面上被吸附的溶質(zhì)濃度; Do:流動(dòng)相中洗脫劑的濃度； Db:填料表面上洗脫劑的濃度； Z:蛋白質(zhì)在吸附過(guò)程中從填料表面上 被置換的洗脫劑的數(shù)目；,以離子交換色譜快速純化 8 一 淀粉酶為例,研究探討離子交換色譜,本研究利用合成的強(qiáng)陰離子交換柱很好地分離了a- 淀粉酶粗品,其活性 回收率高達(dá)96%,比活性達(dá)388ug/mg蛋白質(zhì)純度提高30倍。此法的研究成功 為大規(guī)模制備高純度 a- 淀粉酶提供了一個(gè)新工藝路線。,高純度的 8 一淀粉酶可作為酶試劑 ,研究生物作用的特性、酶反應(yīng)機(jī)理,測(cè)定 生化反應(yīng)的平衡常數(shù)。,1.0 摘要：,6,

3、學(xué)習(xí)交流PPT,2.0實(shí)驗(yàn)部分, 2.1標(biāo)準(zhǔn)酶液配制 用微量天平準(zhǔn)確稱取5mg高純度的 a-淀粉酶試劑,于小離心 試管中,準(zhǔn)確加1.0ml水,溶解后 ,在1300r/min的高速離心機(jī)上離心5min,小心轉(zhuǎn)移上部清液于另一離心試管中,此液相當(dāng)于1062u/ml活力.,7,學(xué)習(xí)交流PPT,8,學(xué)習(xí)交流PPT,9,學(xué)習(xí)交流PPT,10,學(xué)習(xí)交流PPT,3.0結(jié)果與討論,3.1 洗脫劑 為獲得高的洗脫效率,本實(shí)驗(yàn)選用0.02mol/L Tris-2mol/LNacl(PH6.0)體系作為洗脫劑.（Tris-指三羥甲基氨基甲烷 ）,11,學(xué)習(xí)交流PPT,12,學(xué)習(xí)交流PPT,13,學(xué)習(xí)交流PPT,由圖

4、2可知 ,在 2.0mol/L以下,隨鹽濃度的增加 ,洗脫能力增大,活性回收率提高。洗脫液中離子強(qiáng)度對(duì)洗脫效率的影 響可歸結(jié)為離子交換平衡的移動(dòng),這種色譜行為表明該固定相具有典型的陰離子交換特性 ,符合離子交換色譜的洗脫規(guī)律。但在2.0mol/L以上 ,隨鹽濃 度增 加洗脫 能力下降。這種反?，F(xiàn)象,可能是由于離子交換柱的多功能特性引起。,14,學(xué)習(xí)交流PPT,實(shí)驗(yàn)證明,離子交換柱不僅有離子交換的作用 ,而且還表現(xiàn)一定的疏水作用的。并且這種疏水作用 ,隨溶液離子強(qiáng)度發(fā)生變化 。當(dāng)洗脫劑 濃度大于 2.0mol/L時(shí),由于溶液的表面張力過(guò)大 ,離子交換劑的疏水作用變得明顯,對(duì)蛋白質(zhì)疏水締合作用增強(qiáng) ,故被吸附 的蛋白質(zhì)難以洗脫,因而 活性回收率下降。 所以選擇抓Nacl濃度為2.0mol/L.,15,學(xué)習(xí)交流PPT,3.3 PH對(duì)活性回收率的影響,16,學(xué)習(xí)交流PPT,17,學(xué)習(xí)交流PPT,18,學(xué)習(xí)交流PPT,19,學(xué)習(xí)交流PPT,總結(jié),凡在溶液中能夠電 離的物質(zhì)通常都可以用離子 交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適 用于無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用 于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，因此