1、細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法 天津大學(xué)藥品生物制品 檢測技術(shù)研究開發(fā)中心 易泰實(shí)驗(yàn)室,第一部分 細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法基礎(chǔ)知識(shí),一.細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 二.鱟試劑（TAL） 三.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水,一.細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品,細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品（RSE ）： 批號(hào)： 981 效價(jià)：9000 單位： EU 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE ）： 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)。,革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),細(xì)菌內(nèi)毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)(脂多糖LPS)： 1.O-特異性多糖鏈(親水端) 2.核心多糖 3.類脂A（生理活性中心）(疏水端),細(xì)菌內(nèi)毒素在水溶液中的狀態(tài)：,！2000版和2005版中國藥典在

2、“細(xì)菌內(nèi)毒素”檢查法中都注明：細(xì)菌內(nèi)毒素溶液要混旋15min和30s。,革蘭氏陰性菌、某些球菌、病毒、螺旋體、立克次體、支原體,內(nèi)毒素,單核巨噬細(xì)胞、多形核白細(xì)胞,產(chǎn)生,特異性與非特異性結(jié)合,腫瘤壞死因子 白介素-1 白介素-6 白介素-8等細(xì)胞因子,單核巨噬細(xì)胞,瀑布樣反應(yīng),前列腺素血小板激活因子一氧化氮等炎癥介質(zhì),全身炎性反應(yīng)綜合征 膿毒癥 膿毒性休克 多器官功能衰竭 死亡,內(nèi)毒素致病機(jī)理：,二.鱟試劑（TAL）,鱟試劑定義(部頒標(biāo)準(zhǔn)):鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的無菌冷凍干燥品.,細(xì)菌內(nèi)毒素和鱟試劑生化反應(yīng)原理：,細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖LPS） 1,3-(d,)-葡聚糖 C因子 C+

3、 B因子 B+ G+ G 凝固酶原 凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝膠）,三.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 1.藥典規(guī)定： 凝膠法： 0.015Eu/ml 定量法： 0.005Eu/ml 2.注意:要使用和鱟試劑同一廠家的檢查用水,第二部分 細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范,一 .標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 二 .樣品檢測 1. 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)(回收率實(shí)驗(yàn)) 2. 日常檢測,一.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作,1.溶解細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 2.稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 3.溶解、分裝鱟試劑 4.加樣 5.生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,1.溶解細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 取效價(jià)為100EU的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支（工作標(biāo)準(zhǔn)品為中國藥品生物制品檢定所研制、標(biāo)定、分發(fā)

4、），開啟，加入1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，然后用封口膜封閉瓶口，在混旋器上混合15分鐘，混旋后得到100EU/ml的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液。,2.稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 等比例稀釋內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度溶液，每一步稀釋前要充分振蕩30秒后再進(jìn)行下一步稀釋。 例：把濃度為100EU/ml的工作品稀釋為10，1，0.1，0.01EU/ml四個(gè)濃度，可按下圖稀釋： 100EU/ml 10EU/ml 1EU/ml 0.1EU/ml 0.01EU/ml,3.溶解、分裝鱟試劑 取2支鱟試劑（裝量為0.6ml），分別加入0.6ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，靜置，待其充分溶解后，將它們混合在一支內(nèi)混勻、待用。取10支儀

5、器定量專用小試管，按2支1組放于試管架上，分別加入0.1ml鱟試劑（注意不要產(chǎn)生氣泡）。,4.加樣 取稀釋好的四個(gè)內(nèi)毒素溶液10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml、0.01EU/ml0.2ml分別加入含有鱟試劑的小試管中，每個(gè)點(diǎn)2個(gè)平行管，注意加樣前應(yīng)混旋內(nèi)毒素溶液30秒，且每個(gè)溶液應(yīng)更換加樣頭。取細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.2ml加入含有鱟試劑的小試管中，做2個(gè)平行管，作為陰性對(duì)照。每個(gè)濃度在加完樣后應(yīng)立即用封口膜封口，放入測定儀中，開始檢測。,10Eu/ml,1Eu/ml,0.1Eu/ml,0.01Eu/ml,0.2ml,0.2ml,0.2ml,0.2ml,0.2ml,檢查用水,0.1m

6、l鱟試劑,5.生成標(biāo)準(zhǔn)曲線 到達(dá)一定時(shí)間后，用鼠標(biāo)點(diǎn)擊細(xì)菌內(nèi)毒素軟件，則計(jì)算機(jī)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。,標(biāo)準(zhǔn)曲線的一些注解說明： 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線成立的條件: a.符合藥典規(guī)定：n 3 平行管 2 b.相關(guān)系數(shù) IrI 0.98 c.平行管間的變異系數(shù)要小于10%(建議值) d.陰性對(duì)照管的內(nèi)毒素反應(yīng)時(shí)間要大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度的反應(yīng)時(shí)間,陰性對(duì)照管的含義： 是否有外來內(nèi)毒素影響標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)。 1.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 2.實(shí)驗(yàn)器材 3.環(huán)境 4.操作過程,2.標(biāo)準(zhǔn)曲線更改的條件： 試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí),需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。 a.鱟試劑批號(hào)改變的時(shí)候 b.操

7、作人員改變的時(shí)候 c.內(nèi)毒素批號(hào)改變的時(shí)候,3.標(biāo)準(zhǔn)曲線存儲(chǔ)的條件： 在相同的條件下，連續(xù)3天做三條合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后擬合成一條合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線，這條標(biāo)準(zhǔn)曲線在符合不更改的條件下，即可一直使用。 相同：試劑、儀器、地點(diǎn)、操作者、時(shí)間,二.樣品檢測,1.干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)(回收率實(shí)驗(yàn)) 2.日常檢測,1.干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)(回收率實(shí)驗(yàn)) 0.1ml鱟試劑+0.2ml供試品2倍稀釋液 0.1ml鱟試劑+0.2ml供試品2倍陽性液 供試品2倍陽性液（PPC管）：供試品2倍稀釋液 含有內(nèi)毒素濃度0.5Eu/ml 回收率 R= x100% (50%-200%),Ct,Cs,Cs-Ct,m,樣品陽性管（PPC管）的制備-

8、互溶法： 1ml樣品原液+1mlCSE溶液（ 1Eu/ml ） 2ml樣品2倍稀釋液（CSE溶液0.5 Eu/ml ）,供試品稀釋倍數(shù)： 2倍 4倍 8倍 16 倍 回收率 R ： 46% 51% 85% 97% 回收率實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1.單一稀釋倍數(shù)：看Et是否真實(shí)可信 2.梯度稀釋倍數(shù)：尋找最小不干擾稀釋倍數(shù),2.日常檢測,0.1ml鱟試劑,+0.2ml供試品8倍稀釋液（Et）,+0.2ml檢查用水 -陰性對(duì)照,1.Ct L 則供試品為不合格產(chǎn)品 2.Ct L 則供試品為合格產(chǎn)品或邊緣產(chǎn)品,回收率實(shí)驗(yàn)更改的條件： 當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)

9、果的變化時(shí),需重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 1.樣品的工藝流程改變的時(shí)候 2.樣品的原料來源改變的時(shí)候,第三部分 細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法原理-動(dòng)態(tài)濁度法,0.2mlCSE溶液10Eu/ml,0.1ml鱟試劑,OD值=-lg (It/Ie)名稱：光密度含義：濁度,10Eu/ml,OD值,t,0,OD值,t,0,10Eu/ml,1Eu/ml,0.1Eu/ml,0.01Eu/ml,OD值,t,0,10Eu/ml,1Eu/ml,0.1Eu/ml,0.01Eu/ml,0.02,OD值,t,0,10Eu/ml,1Eu/ml,0.1Eu/ml,0.01Eu/ml,0.02,T1,T3,T2,T4,t,C,lgt,lgC,lg10,lg1,lg0.1,lg0.01,lgT4,lgT3,lgT2,lgT1,0,OD值,t,0,10