1、溫自家抗體的血清學(xué)檢測(cè),北京市紅十字血液中心 范道旺,溶血性貧血的分類,自家免疫性溶血性貧血 藥物誘導(dǎo)免疫性溶血性貧血 同種免疫引起的免疫性溶血性貧血 新生兒溶血 溶血性輸血反應(yīng),自家免疫性溶血性貧血,溶血類型： 所占比例（%） 溫自家溶血性貧血（WAIHA） 4870 冷凝集素病（CHD) 1632 混合型（即溫型和冷型并發(fā)） 78 突發(fā)性冷型血紅蛋白尿癥（PCH) 2，主要見于 兒童 DAT-陰性溶血性貧血 1218,免疫性溶血性貧血血清學(xué)特征,WAIHA CHD 混合AIHA PCH 藥物誘導(dǎo) 占有率 4870% 1632% 78% 2%，主要兒童 1218% DAT IgG: 單純 C

2、3 IgG+C3 單純C3 IgG 2060% 9198% 71100% 94100% 94% IgG+C3 IgG+C3 2463% 6% C3:714% 抗體類型 主要 IgG IgM IgG, IgM IgG IgG 放散液 IgG 無 IgG 無 IgG 特異性 主要是Rh 主要抗-I 抗-P 系統(tǒng)抗體,不同AIHA患者DAT反應(yīng)特征,DAT IgG C3 血清特征 放散液特征 WAIHA + + 57%有IgG自家抗體 有IgG,與正常 細(xì)胞反應(yīng) + 0 0 + CHD 0 + 存在IgM自家抗體 無反應(yīng)活性,檢測(cè)溫自身抗體的目的,用于確定： 是否有溫自身抗體致敏在患者自身紅細(xì)胞上

3、患者血清中是否存在溫自身抗體 患者血清中是否同時(shí)存在同種抗體 據(jù)報(bào)道：1540%的有免疫史的WAIHA患者血清中伴隨有同種抗體。,溫自身抗體引發(fā)的血清學(xué)問題,ABO定型 Rh定型 DAT試驗(yàn) 抗體篩查及抗體鑒定 自身抗體的評(píng)價(jià) 同種抗體的篩查和鑒定,自家凝集導(dǎo)致的ABO正反定型不相符,正定（抗體血清） 反定（試劑紅細(xì)胞） 抗-A 抗-B 抗-D 陰性對(duì)照 A細(xì)胞 B細(xì)胞 w+ w+ 3+ w+ 4+ 4+ 對(duì)于極端的個(gè)例，包被了大量的IgG抗體紅細(xì)胞在定型血清中會(huì)發(fā)生自發(fā)的凝集，使用試劑的稀釋液作為陰性對(duì)照，可以發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)弱的自發(fā)凝集產(chǎn)生的陽性反應(yīng)，從而干擾定型。 一般而言，由于溫自身抗體屬于不

4、完全抗體，即使包被大量此抗體的紅細(xì)胞，正定型時(shí)與抗-A或抗-B混合后，也不會(huì)自發(fā)凝集。同樣，反定型時(shí)血清中的溫自身抗體和反定型紅細(xì)胞在室溫鹽水介質(zhì)也不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。,WAIHA患者的Rh定型,由于鹽水介質(zhì)抗-D試劑中添加了增強(qiáng)劑，因此，容易導(dǎo)致包被溫自身抗體的D（-）紅細(xì)胞自發(fā)凝集，產(chǎn)生假陽性，因此必須要用試劑廠商的試劑稀釋液做陰性對(duì)照。只有陰性對(duì)照為陰性時(shí)結(jié)果才可靠(在訂購(gòu)試劑時(shí)要含有陰性對(duì)照）。 紅細(xì)胞包被的IgG抗體不能通過洗滌而除去，因此，為了準(zhǔn)確定型，必須采用放散的方法來除去包被在紅細(xì)胞上的IgG抗體，得到DAT陰性的紅細(xì)胞來定型。,DAT陰性紅細(xì)胞的制備,甘氨酸-EDTA法 二磷酸

5、氯喹法,甘氨酸-EDTA法去除IgG抗體（1）,試劑： 10% Na2EDTA 0.1 M 甘氨酸-HCl緩沖液（pH 1.5): 0.75g甘氨酸溶于100ml生理鹽水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH到1.5 1.0 M Tris-NaCl: 12.1g tris 和5.25g NaCl溶于100ml蒸餾水。,甘氨酸-EDTA法去除IgG抗體（2）,方法： 待處理紅細(xì)胞鹽水洗滌6次 酸化-甘氨酸-EDTA液：甘氨酸-HCl和EDTA按照20：5的體積比混合。 在試管中將紅細(xì)胞和酸化-甘氨酸-EDTA液按照10：20體積比充分混合，室溫孵育23分鐘。 向試管中添加1體積的Tris-NaCl, 混勻后于900

6、-1000g離心1分鐘，棄上清液，鹽水洗滌紅細(xì)胞4次。 用抗-IgG檢測(cè)洗滌后的紅細(xì)胞，確認(rèn)DAT陰性，表明包被在紅細(xì)胞上的IgG抗體已經(jīng)去除。,氯喹放散法（1）,試劑： 二磷酸氯喹：20g二磷酸氯喹溶于100ml鹽水，用1N NaOH調(diào)節(jié)pH到5.1。 DAT陽性的紅細(xì)胞（包被IgG） 對(duì)照細(xì)胞（已知部分血型） 抗-IgG血清,氯喹放散法（2）,方法： 0.2ml鹽水洗滌的壓積紅細(xì)胞和0.8ml氯喹液混合。室溫放置30分鐘。同時(shí)做對(duì)照。 取出部分細(xì)胞，鹽水洗滌4次，進(jìn)行DAT試驗(yàn)，如果DAT為陰性，則放散完成，將全部處理后的細(xì)胞洗滌備用。否則繼續(xù)處理30分鐘后檢測(cè)。,WAIHA的DAT,單純

7、IgG抗體引起 20 66% IgG+C3 2463% 單純C3 714% 極少數(shù)：IgA或溫反應(yīng)性IgM抗體,溫自身抗體DAT反應(yīng)結(jié)果,多特異性AHG 3+ 4+ 抗-IgG 3+ 4+ 抗-C3 0 3+ 陰性對(duì)照 0,溫自身抗體的篩選反應(yīng)格局,鹽水立即離心 37 IAT I 0 0 04+ II 0 0 04+,WAIHA的抗體篩查及抗體鑒定,患者的病歷信息 分析產(chǎn)生DAT陽性的原因 只有自家抗體（無免疫史） 自家抗體可能合并同種抗體（有免疫史） 藥物抗體（治療用藥情況）,患者的病歷信息,臨床診斷 原發(fā)性：無任何關(guān)聯(lián)疾病的情形下發(fā)生 繼發(fā)性：其他疾病相合并發(fā)生：如淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血

8、病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、其他自家免疫疾病、卵巢腫瘤以及其他慢性炎癥。 治療所用藥物 有好幾種藥物可以誘導(dǎo)產(chǎn)生和WAIHA一樣的血清學(xué)反應(yīng)。如：甲基多巴和甲基芐肼。 免疫史（輸血史、妊娠史） 輸血史對(duì)于判定患者血清中的是否存在同種抗體非常重要。據(jù)報(bào)道，1540%的有輸血史或妊娠史的WAIHA患者血清中除自身溫抗體外，還伴隨有同種抗體。,WAIHA的抗體篩選和鑒定,無免疫史的WAIHA檢測(cè)：直接進(jìn)行抗體鑒定，檢測(cè)抗體特異性，如果有特異性，選擇無對(duì)應(yīng)抗原的血液可以輸用。 有免疫史的WAIHA患者檢測(cè)： 放散試驗(yàn) 吸收試驗(yàn)： 無近期（23月內(nèi)）輸血史患者：采用自身吸收 近期有輸血史或嚴(yán)重貧血的患者：采用異

9、體吸收 抗體篩查及抗體鑒定 藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的AIHA，采用放散試驗(yàn)，檢測(cè)放散液,增強(qiáng)自身抗體強(qiáng)度的方法,LISS 微膠柱 固相化技術(shù) PEG-IAT,自身細(xì)胞放散試驗(yàn)?zāi)康?確定是否存在溫自身抗體 確定DAT陽性的原因是否是同種抗體引起而不存在溫自身抗體。 放散液和一些試劑紅細(xì)胞出現(xiàn)陰性反應(yīng)表明血清中存在特異性同種抗體。 確定是否是藥物引起的免疫性溶血性貧血： 放散液反應(yīng)陰性可能是藥物依賴性抗體導(dǎo)致的，由于放散液中缺乏藥物，所以產(chǎn)生陰性反應(yīng)。,WAIHA樣本何時(shí)進(jìn)行放散,評(píng)估第一個(gè)樣本 首次放散的目的是來確認(rèn)溫自身抗體引起的WAIHA，從而排除藥物依賴性抗體的干擾。放散液必須和所有的試劑紅細(xì)胞產(chǎn)生

10、典型的陽性反應(yīng)。 每個(gè)樣本： 不需要對(duì)WAIHA患者的每一份都進(jìn)行放散，因?yàn)檠鍖W(xué)反應(yīng)格局不會(huì)因?yàn)橥换颊卟煌瑯颖径p易發(fā)生改變。 簡(jiǎn)單的血清學(xué)檢驗(yàn)已經(jīng)表明是WAIHA，仍然需要進(jìn)行放散檢測(cè) ： 可以確定是否存在藥物依賴性抗體，如果藥物導(dǎo)致，則更換治療藥物。 如果放散液中有同種抗體，則可能和抗體鑒定譜細(xì)胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)。產(chǎn)生DAT/自身對(duì)照為陽性的原因不一定全部是患者的抗體引起的，如患者最近輸注了已經(jīng)包被抗體的供者紅細(xì)胞。,溫自身抗體的特異性,大多數(shù)是多特異性抗體，且和Rh系統(tǒng)抗原相關(guān)。用Rhnull或D-細(xì)胞來鑒定 。 類似特異性：如類似抗-c,抗-e特異性（指此抗體和具有該抗體對(duì)應(yīng)抗原的紅細(xì)

11、胞反應(yīng)強(qiáng)度要明顯強(qiáng)于缺乏對(duì)應(yīng)抗原的紅細(xì)胞） 具有單特異性：如抗-e、抗-c、抗-D、抗-E、抗-C的特異性抗體。 其他系統(tǒng)：很少見，如Kidd、Kell、LW、Duffy、Ena等。 一般不需要對(duì)自身溫抗體進(jìn)行抗體特異性鑒定。因?yàn)榻^大多數(shù)自身抗體屬于Rh系統(tǒng)的抗體，且具有多特異性，只有少數(shù)具有單特異性。且溫自身抗體鑒定無助于疾病的診斷、治療以及輸血，因此不需要常規(guī)進(jìn)行。,溫自身抗體與不同Rh型反應(yīng),紅細(xì)胞Rh血型 正常血型 部分缺失 全部缺失 （cde/cde,等) （ -D-/-D-等） （Rhnull) 抗-nl + 0 0 抗-pdl + + 0 抗-dl + + +,避免溫自身抗體檢出

12、的方法,試管方法： LISS-IAT 鹽水IAT,溫自身抗體的吸收去除,自身吸收（近期未輸血） 同種吸收： 未知患者血型 已知患者血型,自身吸收,DAT陰性自身紅細(xì)胞的化學(xué)處理： ZZAP 菠蘿酶或木瓜酶 DTT或2-ME 酶：菠蘿酶或木瓜酶,ZZAP處理紅細(xì)胞（1）,試劑： 1%酶：如無花果酶、菠蘿酶等 pH分別為6.5和8.0的PBS 0.2 M的DTT: 1g DTT溶于32.4ml的pH 8.0的PBS 待吸收血清/血漿 2ml 自身壓積紅細(xì)胞（DAT陰性） ZZAP試劑：1ml 1%的無花果酶、2.5ml 0.2M DTT、2ml pH 6.5的PBS, 混合。,ZZAP處理紅細(xì)胞（

13、2）,方法： 2ml 壓積細(xì)胞分裝2管，1ml/管。 將1ml 壓積細(xì)胞和2ml ZZAP試劑混合，37度孵育2030分鐘，間歇搖勻。 鹽水洗滌3次（9001000g)，除盡末次洗滌上清液。加入待吸收血清，混勻后37度孵育2045分鐘。 離心，上清液轉(zhuǎn)移至另一支含處理后紅細(xì)胞的試管中吸收。 用篩選紅細(xì)胞以及自身DAT陰性紅細(xì)胞檢測(cè)吸收后血清。,影響吸收的循環(huán)次數(shù)的因素,與血清中抗體的反應(yīng)強(qiáng)度有關(guān) 測(cè)定抗體的倍比稀釋度，以產(chǎn)生陽性的最后一管來可以用于確立稀釋的循環(huán)次數(shù)。 如效價(jià)為16，需要準(zhǔn)備4管紅細(xì)胞，吸收4次。,確定吸收的循環(huán)次數(shù)（2）,測(cè)定血清中抗體的反應(yīng)強(qiáng)度 吸收循環(huán)次數(shù)為反應(yīng)強(qiáng)度再加1

14、。 如IAT反應(yīng)強(qiáng)度為3+，則吸收循環(huán)次數(shù)為4次。,異體吸收,吸收用細(xì)胞血型 剩余抗體 R1R1, (CCee) -c, -E R2R2, (ccEE) -e, -C rr (ccdee) -D, -C, -E,異體吸收后檢測(cè)（吸收是否完全）,吸收后血清 檢測(cè)用紅細(xì)胞 R1R1吸收 R2R2吸收 rr吸收 R1R1 0 R2R2 0 rr 0,異體吸收后血清檢測(cè)（特異性1）,不同Rh血型紅細(xì)胞異體吸收后的每一份血清分別用R1R1、R2R2和rr紅細(xì)胞，使用IAT方法檢測(cè)，結(jié)果均為陰性， 表明：一、溫自家抗體已經(jīng)完全通過異體 吸收去除。 二、溶貧患者血清中不存在同種抗 體。,異體吸收后血清檢測(cè)（

15、特異性2）,不同Rh血型紅細(xì)胞異體吸收后的每一份血清分別用R1R1、R2R2、rr紅細(xì)胞以及患者自身DAT陰性的紅細(xì)胞使用IAT方法檢測(cè)，結(jié)果出現(xiàn)陽性,表明異體吸收不夠充分，只是反應(yīng)強(qiáng)度減弱，需要繼續(xù)進(jìn)行吸收試驗(yàn)。,異體吸收后血清檢測(cè)（特異性3）,不同Rh血型紅細(xì)胞異體吸收后的每一份血清分別用R1R1、R2R2和rr紅細(xì)胞，使用IAT方法檢測(cè)，結(jié)果出現(xiàn)陽性，而和自身DAT陰性細(xì)胞反應(yīng)為陰性，表明： 存在同種抗體 1、用DAT陰性紅細(xì)胞檢測(cè)吸收后血清 2、用吸收用的紅細(xì)胞檢測(cè)用其吸收后的 對(duì)應(yīng)的血清 3、鑒定存在的同種抗體。,吸收后血清檢測(cè)（特異性4）,當(dāng)吸收后血清的反應(yīng)強(qiáng)度沒有減弱，表明自身抗

16、體的對(duì)應(yīng)抗原是可以被ZZAP試劑破壞，此時(shí)應(yīng)該： 1、用ZZAP或酶處理后的紅細(xì)胞檢測(cè)未作吸收的血清。 2、用未處理的紅細(xì)胞進(jìn)行吸收。,DAT陰性的WAIHA,自身抗體屬于低親和力的IgG抗體 紅細(xì)胞上結(jié)合的IgG數(shù)量太少，DAT檢測(cè)不出來陽性 自身抗體屬于IgM性質(zhì)或IgA性質(zhì),DAT陰性的WAIHA的檢測(cè)（1),使用增強(qiáng)DAT檢測(cè)方法 1、冷鹽水洗滌紅細(xì)胞 2、冷LISS液洗滌紅細(xì)胞 3、PEG-DAT試驗(yàn) 4、聚凝胺-DAT試驗(yàn) 5、ELAT 6、流式細(xì)胞儀檢測(cè),DAT陰性的WAIHA的檢測(cè)(2),抗體檢測(cè)的增強(qiáng)方法 1、酶方法 2、PEG 3、微膠柱 4、聚凝胺,DAT陰性的WAIHA

17、的檢測(cè)（3）,放散液檢測(cè)： 1、濃縮放散液（如1ml細(xì)胞加0.2ml鹽水 放散） 2、用增強(qiáng)技術(shù)方法檢測(cè)放散液 PEG 微膠柱,WAIHA患者的輸血（1）,原則建議不要輸血，因?yàn)閷?duì)于WAIHA患者： 1、患者機(jī)體對(duì)于貧血已經(jīng)具有耐受性，除非病人的生命處在危險(xiǎn)中，血色素明顯快速下降，已經(jīng)危及到患者生命安全，否則不要輸血。 2、很難找到完全相配合的血液： WAIHA患者輸血要比常規(guī)的輸血治療更加危險(xiǎn)，由于很難找到和患者相配合的血液（即缺乏自身抗體相對(duì)應(yīng)抗原的血液）；因此輸入的血液和自身血液一樣都是不配合的，且輸入的紅細(xì)胞在體內(nèi)存活期短于自身細(xì)胞。,WAIHA患者的輸血（2）,3、輸血會(huì)引起患者同種

18、免疫，容易產(chǎn)生同種抗體，給以后輸血造成困難。 4、輸血有可能導(dǎo)致溶血病情加重： （1）由于自身抗體的存在，很難排除是否存在 同種抗體，輸血可能導(dǎo)致輸血反應(yīng)。 （2）輸血會(huì)促進(jìn)自身抗體的生成，加快溶血速 度，且輸入的紅細(xì)胞干擾血清學(xué)檢測(cè)。,WAIHA患者的輸血 （3）,（3）、輸血會(huì)抑制患者自身的代償性造血機(jī)能，反而加重病情。 （4）對(duì)于WAIHA患者，溶血也是線性的，即體內(nèi)紅細(xì)胞越多，溶血的就越多，因此輸血增加了患者的血容量，同時(shí)造成更多輸入的紅細(xì)胞溶血，產(chǎn)生的血紅蛋白造成患者臟器如腎臟負(fù)擔(dān)加重。,WAIHA患者的輸血（4）,血色素超過8g/L的慢性WAIHA患者很少需要輸血，很多5g/L甚至更低的患者也不必輸血治療。 當(dāng)患者必須輸血來挽救生命時(shí)，需要輸血治療，以提供足夠的攜氧能力，如： 患者血色素快速下降，數(shù)值很低且血壓過低 血色素快速下降引起的嚴(yán)重貧血 患者嚴(yán)重貧血并伴發(fā)心肺疾病 患者出現(xiàn)缺氧的癥狀 輸注量：以維持足夠攜氧能力的最少量的紅細(xì)胞，且在輸注過程中密切觀察患者情況。,WAIHA患者的交叉配血,未吸收的原血清, IAT交叉不配