1、第五章 轉(zhuǎn)錄起始復合物的組裝,第一節(jié) dna結(jié)合蛋白及其結(jié)合位點,dna結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特征,轉(zhuǎn)錄因子的三個結(jié)構(gòu)組成部分 1）dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域（分類依據(jù)） 2）連接域 3）轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域,dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域常見類型,螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序(helix-turn-helix motif, hth, 圖a) 鋅指基序(zinc finger motif, 圖b,) 亮氨酸拉鏈基序(leucine zipper motif，圖c) 螺旋-環(huán)-螺旋基序(heliex-loop-helix motif, 圖d),螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix,hth）基序,兩段螺旋被一短的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)分開，其

2、中一段螺旋為 dna 識別螺旋。 同源異形結(jié)構(gòu)域(homeodomain，由同源異形盒編碼)中含有hth 基序。具有homeodomain的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白在胚胎發(fā)育和正常細胞分化的基因表達調(diào)節(jié)中有重要作用。,鋅指(zinc finger)基序,由肽鏈的保守序列中的一對組氨酸加一對半胱氨酸(his2cys2)或2 對半胱氨酸(cys2cys2)與一個鋅離子形成配位鍵，這些氨基酸對之間的多膚鏈成環(huán)狀突出并折迭成指形結(jié)構(gòu)，多個指結(jié)構(gòu)常串聯(lián)重復。 鋅指族轉(zhuǎn)錄因子以二聚體形式同 dna 上的順式調(diào)控元件結(jié)合。 含鋅指基序的轉(zhuǎn)錄因子：與 gc 盒結(jié)合的spl、類固醇激素受體家族，抑癌蛋白wt1 等。,亮氨酸

3、拉鏈(leucine-zipper)基序,由一段每隔 6 個a a就有一個leu 的伸展肽鏈組成，這些周期性出現(xiàn)的leu 都位于螺旋的同側(cè)面，因此兩條均含leu 拉鏈基序的蛋白質(zhì)通過亮氨酸側(cè)鏈的相互作用形成二聚體。 具有亮氨酸拉鏈基序的轉(zhuǎn)錄因子：原癌基因 c-jun/c-fos(apl 家族),螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix，hlht)基序,由 2 個螺旋間隔一個非螺旋的環(huán)(loop)組成如原癌基因產(chǎn)物 c-myc 及其結(jié)合蛋白max 含 hlh 和leu-拉鏈基序的轉(zhuǎn)錄因子的相似性： 均至少含有一個螺旋，其中都有一側(cè)親水面和一側(cè)疏水面，因此這兩種基序又稱為兩親螺旋基序 兩類

4、轉(zhuǎn)錄因子均依靠螺旋氨基端附近的堿性區(qū)（帶正電荷 aa 區(qū)）與dna 結(jié)合，因此又分別稱為bzip 和bhlh （b=basic，堿性) 兩類轉(zhuǎn)錄因子活性都依賴于二聚體化,凝膠阻滯分析,凝膠阻滯實驗可鑒定出與蛋白質(zhì)結(jié)合的dna片段,第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄起始中dna與蛋白質(zhì)相互作用,dna-蛋白質(zhì)相互作用是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方式,dna: 順式調(diào)控元件(cis-regulating element),是指對基因表達有調(diào)控活性的dna 序列，其活性只影響與其自身同處于一個dna分子上的基因 蛋白質(zhì)：反式作用因子(trans-acting factor)是通過識別和結(jié)合順式調(diào)控元件的核心序列而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組

5、蛋白質(zhì),dna-蛋白質(zhì)相互作用,順式調(diào)控元件,啟動子(promoter) 增強子(enhancer) 負調(diào)控元件沉默子(silencer) 絕緣子 其它順式調(diào)控元件： 1）應答元件(responsive elements) 真核細胞中對某些特定的環(huán)境作出應答的基因，常具有相同的順式元件應答元件 應答元件能被在一些特定情況下表達的調(diào)控因子識別(又稱為可誘導的順式調(diào)控元件反式作用因子)。 2）轉(zhuǎn)座元件,rna聚合酶與啟動子的結(jié)合方式,直接結(jié)合，細菌,通過dna結(jié)合蛋白間接結(jié)合，真核生物,細菌rna聚合酶結(jié)合于啟動子序列,細菌中rna聚合酶結(jié)合的靶序列叫做啟動子。,大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子,真核細

6、胞啟動子更加復雜,真核生物中，啟動子一詞用于指所有對基因轉(zhuǎn)錄起始有重要作用的序列。 這些序列可能有多個，各具有不同的功能，不僅包括作為起始復合物組裝位點的核心啟動子（有時也叫做基本啟動子），還包括一個或多個位于核心啟動子上游的上游啟動子元件。,轉(zhuǎn)錄起始事件,rna 聚合酶結(jié)合核心啟動子 封閉的啟動子復合物轉(zhuǎn)換為開放的啟動子復合物 rna合成的起始 啟動子清除：聚合酶向啟動子下游移動,第三節(jié) 細菌轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控,細菌的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控,轉(zhuǎn)錄起始 1）組成型控制：依賴于啟動子結(jié)構(gòu) 2）調(diào)節(jié)型控制：操縱子學說，依賴于調(diào)解蛋白水平,啟動子(promoter),與基因轉(zhuǎn)錄啟動有關(guān)的一組dna 序列，一般位于轉(zhuǎn)

7、錄起始點上游100-200bp 以內(nèi)，其功能是決定轉(zhuǎn)錄的起始點和調(diào)控轉(zhuǎn)錄頻率 原核啟動子： 1）-35框： 5-ttgaca-3 2）-10框 5-tataat-3,細菌啟動子結(jié)構(gòu)決定轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)水平,細菌啟動子共有序列是可變的 1）-10框：t80a95t45a60a50t96 影響啟動子復合物從封閉向開放的轉(zhuǎn)換 2）-35框：t82t84g78a65c54a45 影響亞基識別，從而影響rna聚合酶結(jié)合 轉(zhuǎn)錄起始點附近及轉(zhuǎn)錄單位前50個核苷酸序列影響轉(zhuǎn)錄起始后的延伸 不同的基因可能有不同的最有效啟動子 啟動子序列突變可能改變轉(zhuǎn)錄起始的基礎(chǔ)水平,大腸桿菌轉(zhuǎn)錄起始,細菌rna聚合酶,結(jié)構(gòu)：核心酶+

8、亞基 1）核心酶：2 2）亞基：啟動子特異性結(jié)合,不同的亞基識別不同的啟動子,70：標準亞基，指導大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄 特定條件下其它亞基被激活 例：熱休克基因的識別,非標準的亞基和其識別序列,操縱子及其相關(guān)概念,操縱子(operon)，指一組在基因組中彼此相鄰的基因，兩基因頭尾間可能僅隔一兩個核苷酸。操縱子的所有基因都作為一個單位表達。 結(jié)構(gòu)基因(structural gene)，編碼非調(diào)控因子的基因。 調(diào)控基因(regulator gene)，編碼調(diào)控蛋白（阻抑物）的基因。 阻抑物(repressor)，能阻止基因表達的蛋白質(zhì)，可與操縱基因結(jié)合來阻止轉(zhuǎn)錄。 操縱基因(operator)，位于啟動

9、子下游可與阻抑物結(jié)合的dna元件，當與阻抑物結(jié)合后調(diào)節(jié)啟動子抑制轉(zhuǎn)錄，常為回文序列。 誘導物(inducer)，通過與阻抑物結(jié)合激活基因轉(zhuǎn)錄的小分子物質(zhì)。,乳糖操縱子,乳糖操縱子的調(diào)控,乳糖阻抑物操縱基因的結(jié)合,乳糖阻抑物以四聚體形式結(jié)合到兩個操縱基因上 另外的兩個操縱基因，一個位于初級操縱基因的上游90bp，另一個位于初級操縱基因的下游400bp。,輔阻抑物與色氨酸操縱子,輔阻抑物(co-repressor)，結(jié)合到阻抑物上來抑制轉(zhuǎn)錄的小分子。,色氨酸阻抑物存在多個靶點：可控制多個基因啟動子,aroh,編碼合成色氨酸的生化通路中早期步驟的特異酶 trpr,色氨酸阻抑物自身基因，調(diào)控色氨酸合成

10、的晚期步驟,抑郁癥患者究竟有多危險？,第四節(jié) 真核生物轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控,真核生物轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控,真核轉(zhuǎn)錄起始比原核生物更復雜 真核轉(zhuǎn)錄起始順式元件的復雜性 1) 核心啟動子 2) 基本啟動子元件 3) 特異性表達元件 4) 遠端調(diào)控元件 真核轉(zhuǎn)錄起始反式因子的復雜性 1) rna聚合酶 2) 激活蛋白和輔激活蛋白 3) 阻抑物 4) 轉(zhuǎn)錄因子的修飾,核心與基本啟動子元件,真核啟動子區(qū)域包括核心啟動子和啟動子上游近側(cè)序列： 1、核心啟動子(core promoter) 是決定轉(zhuǎn)錄起始位置的關(guān)鍵序列，也是普通轉(zhuǎn)錄因子tfd 的結(jié)合位點， tata 盒(tata box) 位于轉(zhuǎn)錄起始點上游-25-30b

11、p 起始子(initiator，inr) inr 是與轉(zhuǎn)錄起始位點重疊的短的較保守序列 注：不是所有基因都含有 tata 盒或inr 序列有的只有其中之一，有的兩者都無 這些核心啟動子的序列和它們之間的間隔多變 2、上游/基本啟動子元件(upstream/basal promoter element，upe) 位于較上游(-30 一-110bp)，能較強影響轉(zhuǎn)錄起始的頻率，如caat 盒和gc 盒其中g(shù)c盒是轉(zhuǎn)錄因子spl 的結(jié)合位點。,特異性表達元件,應答模塊(response module)，使轉(zhuǎn)錄起始能響應細胞外一般信號元件。如，camp應答模塊cre(5-a/tcgtca-3) 細胞特

12、異性模塊(cell-specific module), 僅在一種組織細胞中特異表達的基因啟動子。如，垂體細胞模塊、脂肪細胞模塊等。 發(fā)育調(diào)節(jié)因子模塊（developmental regulator），介導特定發(fā)育階段的基因表達的元件。,真核順式元件和反式因子的多層次,順式元件： 1）啟動子(promoter) 2）增強子(enhancer) 3）負調(diào)控元件沉默子 (silencer) 4）絕緣子 反式因子 1）激活物: 特異結(jié)合dna 2）輔激活物：不特異結(jié)合dna，通過蛋白質(zhì)間相互作用 3）中介子（mediator）: 激活蛋白與rna聚合酶ii間 4）阻抑物,增強子(enhancer),能

13、顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的一類順式調(diào)控元件（其核心序列常為8-12bp) 增強子的作用特點： 1）能(通過啟動子)提高同一條鏈上的靶基因轉(zhuǎn)錄速率； 2）增強子對同源基因或異源基因同樣有效； 3）增強子的位置可在基因5-上游、基因內(nèi)或3下游序列中； 4）自身沒有5-或3-方向性； 5）增強子可遠離轉(zhuǎn)錄起始點(最多30kb)； 6）增強子一般具有組織或細胞特異性,rna聚合酶,rna 聚合酶i, 轉(zhuǎn)錄28s, 5. 8s 和18s 核糖體 rna (rrna) rna 聚合酶，負責真核生物蛋白編碼基因和大部分小核rna（snrna)的轉(zhuǎn)錄，有7-10 個亞基，最大亞基的羧基末端結(jié)構(gòu)域(ctd)具有7

14、個氨基酸(tyr-ser-pro-thr-ser-pro-set)的重復序列，其中有多個磷酸化位點ctd 磷酸化對調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄有重要作用 rna 聚合酶iii,轉(zhuǎn)錄trna, 5s rrna, u6-snrna, 小核仁rna (snorna), 小細胞質(zhì) rna (serna),基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(basal transcription factor),真核基因轉(zhuǎn)錄除 rna 聚合酶外，還需要許多蛋白因子轉(zhuǎn)錄因子參加，其中一些轉(zhuǎn)錄因子是rna 聚合酶轉(zhuǎn)錄起始必需的，并且可以維持基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，因此稱為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子或普通轉(zhuǎn)錄因子(general transcription factor) rna 聚

15、合酶 ii 的普通轉(zhuǎn)錄因子(tf ii)包括tfiid,tfb,tfiif，tfiie，tfiih，tfiia 等 tfiid 是最先結(jié)合到dna上的轉(zhuǎn)錄因子，由tata結(jié)合蛋白（tata-binding protein, tbp)和12個tbp相關(guān)因子（taf, tbp-associated factor)組成,rna聚合酶ii的轉(zhuǎn)錄起始(1),rna聚合酶ii的轉(zhuǎn)錄起始（2）,三個關(guān)鍵事件： tbp的結(jié)合誘導tata框區(qū)段dna形成彎曲 dna彎曲提供了tfiib識別的結(jié)構(gòu)，從而保證了rna聚合酶ii在轉(zhuǎn)錄起始位點上的正確定位 tfiih破環(huán)堿基配對，這是形成開放啟動子所必需的,激活物(activator),激活轉(zhuǎn)錄起始的蛋白質(zhì) 可能結(jié)合于啟動子區(qū)域，影響單個基因的轉(zhuǎn)錄，也可能結(jié)合于增強子區(qū)域，影響多個基因的轉(zhuǎn)錄 可與前起始復合物相互作用，作用的部位稱為激活域(activation dom