1、課題3 血紅蛋白的提取和分離,主要內(nèi)容： 一、基礎(chǔ)知識(shí) 二、實(shí)驗(yàn)操作,一、基礎(chǔ)知識(shí)-蛋白質(zhì)分離和提取的原理, 凝膠色譜法（分配色譜法）,1、凝膠：,一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖）,2、概念：,根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法,3、原理：,4、具體過程,一、基礎(chǔ)知識(shí)-蛋白質(zhì)分離和提取的原理,一、基礎(chǔ)知識(shí)-蛋白質(zhì)分離和提取的原理,用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì) A路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢 B路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快 C路程較短，移動(dòng)速度較慢 D路程較短，移動(dòng)速度較快,D,相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過程可表示為圖中哪一個(gè),B,1、

2、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。, 緩沖溶液：,2、作用： 能夠抵制（ ）對(duì)溶液（ ）的影響，維持PH基本不變。,外界的酸或堿,pH值,3、緩沖溶液的配制,通常由（ ）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（ ）就可以制得（ ）使用的緩沖液。,12,使用比例,在不同PH范圍內(nèi),思考：說出人體血液中緩沖液。,NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3,磷酸緩沖液，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究其(活性),4、在本課題中使用的緩沖液？,（三） 電泳

3、：,1.概念：,帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。,2.原理：,許多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,3.類型:,瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。,在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng),瓊脂糖凝膠電泳示意圖,4、聚丙稀酰胺凝膠電泳,（1）聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N，亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)

4、劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。,蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。 為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。,（2）原理：,SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。,（3）SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳作用機(jī)理:,4、聚丙稀酰胺凝膠電泳,使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程

5、中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于 A 電荷的多少 B 分子的大小 C 肽鏈的多少 D 分子形狀的差異,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： （1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。 （2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。 （3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。 （4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。,二、實(shí)驗(yàn)操作：樣品處理粗分離純化純度鑒定,1. 血液有哪些成分？,2. 你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動(dòng)物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？,二、實(shí)驗(yàn)操作：樣品處理粗分離純化純度鑒定,知識(shí)回顧,（一）樣品處理,1、紅細(xì)胞的洗滌： 2、血

6、紅蛋白的釋放： 3、分離血紅蛋白溶液： 4、透析：（如何除無機(jī)鹽離子和小分子有機(jī)物質(zhì)呢？）,血液檸檬酸鈉低速短時(shí)離心吸出上層血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水 緩慢攪拌10min低速短時(shí)離心吸出上清液反復(fù)洗滌直至上清液無黃色,在蒸餾水和甲苯（？）作用下，紅細(xì)胞破裂釋放,紅細(xì)胞破碎混合液中速長(zhǎng)時(shí)離心（2000c/min10min）濾紙過濾除去脂質(zhì)分液漏斗分離出血紅蛋白，得到紅色透明液體。,裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。,二、實(shí)驗(yàn)操作：樣品處理粗分離純化純度鑒定,分離血紅蛋白溶液,有機(jī)溶劑 無色透明的甲苯層,脂類物質(zhì) 白色脂溶性物質(zhì)沉淀層,血紅蛋白溶液 紅色透明液體,紅細(xì)胞破碎物沉淀

7、暗紅色沉淀物,透析過程動(dòng)畫演示,練習(xí)鞏固,1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是 A 弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) B 弄清各種蛋白質(zhì)的功能 C 弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程 D 獲得高純度的蛋白質(zhì),2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是 A 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) B 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) C 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) D 二者根本無法比較,3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于 A 電荷的多少 B 分子

8、的大小 C 肽鏈的多少 D 分子形狀的差異 4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是 A 調(diào)節(jié)pH B 維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng) C 防止微生物生長(zhǎng) D 防止血液凝固,5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的 O2分子數(shù)和CO2分子數(shù)分別是 A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1 6、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是： 有機(jī)溶劑-脂類物質(zhì)-血紅蛋白溶液 -紅細(xì)胞破碎物沉淀,（二）凝膠色譜操作-純化,1、凝膠色譜柱的制作：,二、實(shí)驗(yàn)操作：樣品處理粗分離純化純度鑒定,色譜柱的制作過程：準(zhǔn)備材料加工橡皮塞 安裝色譜柱,2、凝膠色譜柱的裝填,裝配好的凝膠柱,3、樣品加入與洗脫-調(diào)節(jié)緩沖液面加

9、入蛋白質(zhì)樣品調(diào)節(jié)緩沖液面洗脫收集分裝蛋白質(zhì),（1）調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 （2）滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 （3）樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 （4）洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。 （5）收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移

10、動(dòng)，說明色譜柱制作成功） （6）注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。,注意：正確的加樣操作是（1）不要觸及并破壞凝膠面。（2）貼壁加樣。（3）使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。,3、樣品加入與洗脫-調(diào)節(jié)緩沖液面加入蛋白質(zhì)樣品調(diào)節(jié)緩沖液面洗脫收集分裝蛋白質(zhì),思考下面的問題：,讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。,1、在血紅蛋白的整個(gè)過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？,2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？,血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫

11、液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。,3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？,血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。,收集得到的純化后的蛋白,在裝填凝膠柱時(shí)，不能有氣泡存在的原因是 A、氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次 序，降低分離效果 B、氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng) C、氣泡與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng) D、氣泡在

12、裝填凝膠的時(shí)候，使凝膠不緊密,A,樣品的加入和洗脫的操作不正確的是 A 加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面 B加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi) C等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口 D用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面,A,下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是（ ） A可采集豬血作為實(shí)驗(yàn)材料 B用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞 C血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時(shí)間離心 D洗脫液接近色譜柱底端時(shí)開始收集流出液,A,三、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,鑒定血紅蛋白純度。,目的：,觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖

13、5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。,四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？,2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？,由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。

14、如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。,如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。,3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？,四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià),本課題作業(yè);,1.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的的原理是怎樣的? 2.什么是緩沖溶液?它的作用是什么? 3.電泳的作用及其原理是什么? 4.你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎? 5.與其他真核細(xì)胞相比,紅細(xì)胞有什么特

15、點(diǎn)?這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行 蛋白質(zhì)的分離有什么意義?,（1）計(jì)算：根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需凝膠量 （2）凝膠溶脹：凝膠浸泡于蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液 （3）固定：將色譜柱裝置固定在支架上 （4）裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。 （5）洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。 裝填時(shí)注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。 洗滌平衡時(shí)注意：1、液面