1、海洋微生物研究相關(guān)技術(shù),中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 海洋藥學(xué)教研室,目錄 contents,概述 海洋微生物研究 研究重點(diǎn)及相關(guān)技術(shù) 培養(yǎng)發(fā)酵 種屬鑒定 關(guān)鍵技術(shù)舉例,海洋微生物,定義： 海洋環(huán)境中能生長(zhǎng)繁殖、形體微小，單細(xì)胞或簡(jiǎn)單多細(xì)胞、甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一類(lèi)低等生物。 與陸生微生物的聯(lián)系和區(qū)別 相似：形態(tài)結(jié)構(gòu)、分類(lèi)鑒定、生理生化、生長(zhǎng)繁殖以及遺傳變異等方面； 區(qū)別：因生長(zhǎng)環(huán)境的差異，在種類(lèi)、生態(tài)分布及次級(jí)代謝產(chǎn)物方面出現(xiàn)差異,海洋藥物開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀,進(jìn)展： 2萬(wàn)余種海洋天然產(chǎn)物 數(shù)百種新化合物進(jìn)行了專(zhuān)利申請(qǐng) 數(shù)十種海洋新藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段 問(wèn)題： 開(kāi)發(fā)成功率較低（10 V.S 25000)

2、 采集技術(shù)：生物量有限，采集困難 分離技術(shù)：化合物分離難度大 藥源問(wèn)題,可持續(xù)海洋開(kāi)發(fā)的思路,海洋微生物的優(yōu)越性,物種多樣性，生物資源豐富 遺傳代謝特征特異，生物活性物質(zhì)多樣性 與其他海洋生物形成完整的生態(tài)系統(tǒng) 易于采集，生長(zhǎng)周期短，研究難度較小 可再生資源解決藥源問(wèn)題 可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)和發(fā)酵,海洋微生物研究發(fā)展,1947年 Zobell等發(fā)現(xiàn)某些海洋微生物具有抗菌活性 1950s末 海洋藥物研究的興起 1980年 Colwell Lab 海洋微生物生物技術(shù)研究 1986年 NCI開(kāi)展海洋微生物研究 1990s- 世界各國(guó)加強(qiáng)了對(duì)海洋微生物研究的力度 1980s 我國(guó)開(kāi)始海洋微生物研究,海洋微

3、生物的多樣性,種類(lèi)多樣性是代謝產(chǎn)物多樣性的基礎(chǔ) 多樣化的環(huán)境是造成微生物種類(lèi)多樣性的重要原因之一 海洋微生物的種類(lèi)多樣性和環(huán)境獨(dú)特性造就了海洋微生物代謝途徑的特殊性多樣性和新穎性,海洋微生物常見(jiàn)種屬,假單胞菌屬Psendomonas G- 弧菌屬Vibrio G- 發(fā)光桿菌屬Photobacterium G- 黃桿菌屬Flavobacterium G- 不動(dòng)桿菌屬Actinetobacter G- 葡萄球菌屬Staphylococcus G+ 微球菌屬M(fèi)icrococcus G+,海洋微生物習(xí)性,生長(zhǎng)溫度： 海洋微生物的最適生長(zhǎng)溫度一般為1822 嗜冷菌和耐冷菌：極地和深海微生物（4 ） 嗜高

4、溫菌和耐熱菌：海底火山口 適壓能力： 嗜壓菌、耐壓菌和嫌壓菌 耐鹽能力： 嗜鹽菌和耐鹽菌 對(duì)氧利用程度： 好氧菌、厭氧菌和兼性厭氧菌 與其他生物關(guān)系： 寄生、附生、共生 內(nèi)共生菌：動(dòng)植物體內(nèi)存在,海洋微生物研究流程,海洋微生物采樣分離流程,樣品采集 水樣 泥樣 其他 微生物分離與培養(yǎng) 培養(yǎng)介質(zhì) 培養(yǎng)條件,菌種鑒定 形態(tài)特征鑒定 生理生化鑒定 遺傳特征鑒定,海洋微生物樣品的采集,水樣的采集 淺層水樣 深海水樣 海底泥樣 大洋型采泥器：表層泥樣 小型底棲生物柱狀采樣管：深層泥樣 地質(zhì)取樣管：巖石層,海洋內(nèi)共生菌（endosymbiont）的采集,內(nèi)共生菌：與宿主互惠共生、協(xié)同進(jìn)化，對(duì)于宿主細(xì)胞具有

5、依賴(lài)性 存在于宿主的整個(gè)生活周期中，可以單獨(dú)復(fù)制、垂直傳播，有不同于宿主的核酸、蛋白合成系統(tǒng) 內(nèi)共生菌對(duì)于宿主的生長(zhǎng)、生殖、代謝、抵御外界侵?jǐn)_具有重要作用 采集和分離時(shí)避免污染，表面消毒,海洋微生物常用分離方法,平板分離法 稀釋涂布平板分離 稀釋混合平板法 平板劃線,稀釋涂布平板法,稀釋混合平板法,平板劃線法,海洋微生物的培養(yǎng),營(yíng)養(yǎng)要求：培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度 18-22； 28 耗氧要求 壓力耐受 其他（如共生生態(tài)模擬）,海洋微生物的培養(yǎng)基,ZoBell培養(yǎng)基（2261E） 主要用于培養(yǎng)海水環(huán)境中的好氧型異氧菌，鹽度一般為2830。,注：陳海水是指海水于暗處儲(chǔ)放數(shù)周后過(guò)濾雜質(zhì)沉淀后的海水

6、。,淡水配制Zobell 2216E培養(yǎng)基,Simidu培養(yǎng)基,主要用于好氧型異養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)。,海洋微藻培養(yǎng)基,人工海水配置，60 滅菌4h,Pfennigs培養(yǎng)基,取AD溶液等體積混合，調(diào)pH至6.87.2。,用于光合細(xì)菌的培養(yǎng),發(fā)光菌培養(yǎng)基,TCBS培養(yǎng)基,無(wú)需高壓滅菌,選擇性培養(yǎng)海洋弧菌,硫酸鹽還原菌培養(yǎng)基,寡營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌的培養(yǎng),海水中添加1.5%的瓊脂即可。,鹽溶液：用于海洋微生物樣品的稀釋,培養(yǎng)條件,溫度： 嗜冷菌：低溫 嗜溫菌：2530 其它條件 光能營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌：光照； 嗜壓微生物：需在一定壓力下進(jìn)行； 厭氧微生物：厭氧培養(yǎng)箱,微生物種屬鑒定技術(shù),微生物分類(lèi)鑒定的經(jīng)典指標(biāo),海洋微生物

7、菌種的分類(lèi)和鑒定,1. 形態(tài)和習(xí)性鑒定 （1）細(xì)菌的形態(tài)特征 群體形態(tài)：菌落的大小、形態(tài)、顏色以及在半固體或液體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況,個(gè)體形態(tài)：菌體大小、形態(tài)、排列、鞭毛狀態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)、芽孢以及莢膜等,（2）生理生化特征,對(duì)碳源、氮源以及能源的利用能力； 產(chǎn)酶種類(lèi)和反應(yīng)特征 代謝產(chǎn)物種類(lèi)和數(shù)量 對(duì)生長(zhǎng)因子的需求,（3）生態(tài)學(xué)特征,對(duì)氧的需求 生長(zhǎng)溫度 pH要求 寄生、共生以及附生 致病性,（4）血清學(xué)反應(yīng) 抗原組成分析：用已知抗原檢測(cè)抗體或以已知抗體檢測(cè)抗原 （5）噬菌反應(yīng) 噬菌體對(duì)宿主菌具有專(zhuān)一性,化學(xué)組分分析,2. 細(xì)胞組分鑒定,紅外光譜、GC以及MS等技術(shù)測(cè)定細(xì)胞組分： 細(xì)胞壁成分、

8、脂類(lèi)、醌類(lèi)、光合色素、氨基酸種類(lèi)等,3. 蛋白質(zhì)檢測(cè),蛋白質(zhì)凝膠電泳 血清學(xué)反應(yīng) 氨基酸序列分析 同工酶分析等,生物分類(lèi)原則,表型分類(lèi)法（Phenetic） 依據(jù)：形態(tài)結(jié)構(gòu)，生理生化，行為習(xí)性等 不涉及生物進(jìn)化或不以反映生物親緣關(guān)系為目標(biāo) 系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)法（ Phylogenetic ） 依據(jù)：系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性水平 反映生物系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化關(guān)系,生物系統(tǒng)學(xué) Systematics,微生物表型分類(lèi)的局限,形態(tài)和生理特征： 形體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)性生殖，化石資源少 可利用的形態(tài)特征少，難以水平比較 不同類(lèi)群形態(tài)特征進(jìn)化差異大，分類(lèi)不準(zhǔn)確,生物大分子作為進(jìn)化標(biāo)尺的依據(jù),蛋白質(zhì)、RNA和DNA序列進(jìn)化速率相

9、對(duì)恒定 分子序列進(jìn)化的改變量(氨基酸或核苷酸替換數(shù)或替換百分率)與分子進(jìn)化的時(shí)間成正比 同一種分子的序列差異很大：進(jìn)化距離遠(yuǎn) 同一來(lái)源的大分子序列基本相同：同一進(jìn)化水平上,進(jìn)化標(biāo)尺生物大分子的選擇原則,普遍存在于研究對(duì)象的種群范圍內(nèi) 在所有物種中，功能相同 序列嚴(yán)格線性排列，可鑒定其中的同源位置或同源區(qū) 序列的改變（突變）頻率與進(jìn)化的測(cè)量尺度相適應(yīng),核酸序列 堿基組成（G+C含量） 分子序列 序列測(cè)定 基因組序列 RNA （16s/18s rRNA） 分子雜交,4. 核酸序列分析,直接比較微生物基因組的差異，結(jié)果更加可信 G+C含量測(cè)定 DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交行為 DNA或RN

10、A序列分析 16s rRNA序列分析,DNA的堿基組成(G+C mol%),G+C占全部堿基的分子百分?jǐn)?shù)(G+C mol%) 表示各類(lèi)生物的DNA堿基因組成特征 DNA堿基因組成是各種生物一個(gè)穩(wěn)定的特征，即使個(gè)別基因突變，堿基組成也不會(huì)發(fā)生明顯變化,G+C mol%鑒定原則,主要用于分類(lèi)鑒定中的否定 G+C%差別大表明親緣關(guān)系遠(yuǎn)，但G+C%接近不代表親緣關(guān)系近； 種內(nèi)的不同菌株G+C%差別應(yīng)在45%以下；同屬差別應(yīng)低于1015%；,G+C%的分類(lèi)學(xué)鑒定意義,作為建立新分類(lèi)單元的一項(xiàng)基本特征和把那些G+C%含量差別大的種類(lèi)排除出某一分類(lèi)單元： 兩個(gè)形態(tài)及生理生化特性方面極其相似的菌株： G+C%

11、差別5%，排除同種的可能 G+C%差別15%，排除同屬的可能,核酸序列分析,DNA堿基排列順序的異同直接反映生物親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近： 堿基排列順序差異越小，親緣關(guān)系越近； 堿基排列順序差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)； 直接比較：比對(duì)DNA堿基順序 間接比較：分子雜交（hybridization）,核酸分子雜交用于親緣關(guān)系鑒定,DNA-DNA雜交 親緣關(guān)系相對(duì)近的微生物之間的親緣關(guān)系比較 DNA-rRNA雜交 親緣關(guān)系相對(duì)遠(yuǎn)的微生物之間的親緣關(guān)系比較 核酸探針雜交 利用特異性探針，用于細(xì)菌等的快速鑒定,16s rRNA 核苷酸序列分析,具有高度保守性, 不同的科、種、屬間的菌16s rRNA 基因的同源性達(dá)

12、97 %以上； 分子大小和信息量適中，便于序列分析； rRNA具有重要且恒定的生理功能，普遍存在于各種生物中；,原核/真核細(xì)胞的核糖體組成,16S rRNA的保守性,16s rRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)（1500bp左右）非常保守; 16s rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有更高的保守性：臂環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop structure),rRNA在生物進(jìn)化中的地位,在原核生物和真核生物中都存在 拷貝數(shù)高 結(jié)構(gòu)保守、功能類(lèi)似，參與蛋白質(zhì)合成 進(jìn)化速率慢，跨越整個(gè)生命進(jìn)化過(guò)程,細(xì)菌分類(lèi)系統(tǒng),Shewan和Oliver的海洋細(xì)菌鑒定系統(tǒng) 美國(guó)細(xì)菌學(xué)家協(xié)會(huì)鑒定和分類(lèi)委員會(huì)的伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)（第十版） 以表型特征為基礎(chǔ)

13、，以DNA序列為依據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)的分類(lèi)，闡明了菌種間的親緣關(guān)系和分類(lèi)地位。,菌種鑒定和分類(lèi)中需注意的問(wèn)題,單菌落 非選擇性培養(yǎng)基 標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照 培養(yǎng)條件（溫度、鹽度和壓力等） 生長(zhǎng)環(huán)境,第三部分,海洋微生物技術(shù)實(shí)例,海洋微生物的菌種鑒定技術(shù),表型分析（phenotypic expression）和生化鑒定 基因組序列鑒定 以 DNA 指紋圖譜為基礎(chǔ)的微生物分型鑒定 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD) 擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析(AFLP) 基于rRNA的序列分析與鑒定 16s/18s rRNA序列分析 16s 23s rRNA 間區(qū)序列分析 Florescent in

14、 situ hybridization,Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP),genome mapping genetic disease analysis,Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD),RAPD is an inexpensive yet powerful typing method for many bacterial species.,簡(jiǎn)便易行，所需樣品量少 重復(fù)性差，信息量??；,Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP),優(yōu)點(diǎn)：精確可靠，

15、多態(tài)性高 缺點(diǎn)：技術(shù)繁瑣，不易自動(dòng)化，費(fèi)用昂貴； 應(yīng)用：各種分子標(biāo)記,基于rRNA序列的分析方法,全序列分析比較 特征序列比較 有助于迅速確定某種微生物的分類(lèi)歸屬，或建立新的分類(lèi)單位,基于rRNA的序列分析,未知微生物,全序列分析,特征序列分析,rRNA全序列分析,系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(phylogenetic tree),通過(guò)比較生物大分子序列差異的數(shù)值構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)； 特點(diǎn)： 用一種樹(shù)狀分枝的圖型概括各種(類(lèi))生物之間的親緣關(guān)系,利用16s rRNA可對(duì)物種進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,含有進(jìn)化速度不同的區(qū)域,可以作為分類(lèi)的基礎(chǔ),16S 23S rRNA 間區(qū) Intergenic Spacer Region,比

16、 16S rRNA 大 10 倍； 含有高度保守的區(qū)域； 在不同種細(xì)菌中拷貝數(shù)、長(zhǎng)度、堿基排列順序以及含有的 tRNA 基因的數(shù)量和種類(lèi)不同；,rRNA序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,在線分析： NCBI Blast 數(shù)據(jù)庫(kù) /Blast.cgi 離線軟件： Clustal UPGMA PAUP4.0 MEGA PHYLIP,基因序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),構(gòu)建16s rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的意義,使生物進(jìn)化的研究范圍真正覆蓋所有生物類(lèi)群； 提出了全新的正確衡量生物間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的方法； 對(duì)探索生命起源及原始生命的發(fā)育進(jìn)程提供線索和理論依據(jù)； 突破了微

17、生物分類(lèi)僅靠形態(tài)學(xué)和生理生化特性的限制，建立了全新的分類(lèi)理論； 為生物多樣性和微生物生態(tài)學(xué)研究建立了全新的研究理論和研究方法，特別是不經(jīng)培養(yǎng)直接對(duì)生態(tài)環(huán)境中的微生物進(jìn)行研究成為可能。,特征序列或序列印記（signature sequence）,通過(guò)對(duì)rRNA全序列資料的分析比較，發(fā)現(xiàn)在不同種群水平上的特異特征性寡核苷酸序列，或在某些特定的序列位點(diǎn)上出現(xiàn)的單堿基印記； 特征序列有助于迅速確定某種微生物的分類(lèi)歸屬，或建立新的分類(lèi)單位。,16s/18s rRNA中的一些特征序列,熒光原位雜交Fluorescence In Situ Hybridization,利用非放射性的熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行

18、檢測(cè)的技術(shù)； 通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA探針與待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)，從而對(duì)特殊細(xì)胞、組織樣本進(jìn)行檢測(cè)和診斷；,Fluorescence In Situ Hybridization,熒光原位雜交技術(shù)的特點(diǎn),將熒光信號(hào)的高靈敏度、安全性，熒光信號(hào)的直觀性和原位雜交的高準(zhǔn)確性結(jié)合起來(lái)； 廣泛運(yùn)用于疾病的診斷和治療、遺傳進(jìn)化分析等,分子雜交 molecular hybridization,使單鏈DNA或 RNA分子與具有互補(bǔ)堿基的另一DNA或RNA片斷結(jié)合成雙鏈的技術(shù)，即核酸分子間的雜交,核酸雜交 nucleic acid hybridization,互補(bǔ)的核

19、苷酸序列（DNA與DNA、DNA與RNA、RNA與RNA等）通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)形成非共價(jià)鍵，形成穩(wěn)定的同源或異源雙鏈分子的過(guò)程，稱(chēng)為核酸分子雜交。 原理：核酸變性和復(fù)性，雙鏈核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開(kāi)，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙鏈。,核酸雜交一般流程,核酸雜交的方式,根據(jù)雜交發(fā)生于固相支持物上與否： 固-液相雜交 膜印跡雜交 原位雜交 液相雜交 核酸酶保護(hù)分析法,核酸雜交類(lèi)型,根據(jù)檢測(cè)樣品: DNA印跡雜交（Southern blot hybridization ） RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）,Souther

20、n blot,1975年由英國(guó)人Southern創(chuàng)建，研究DNA圖譜的基本技術(shù)。 印跡 blotting：將待測(cè)分子通過(guò)一定方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上； 雜交 hybridization：固定于膜上的分子與經(jīng)標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火并結(jié)合；,印跡技術(shù),Southern blottingDNA印跡技術(shù) Northern blottingRNA印跡技術(shù) Western blotting蛋白質(zhì)印跡技術(shù) Dot blotting不經(jīng)凝膠的印跡技術(shù),探針與標(biāo)記,探針（Probe）： 特異性地與靶分子發(fā)生互相作用，并可被檢測(cè)的分子。 根據(jù)堿基配對(duì)原則，結(jié)合于待

21、測(cè)核酸的核酸片段。 標(biāo)記技術(shù)（Labeling）： 放射性標(biāo)記 放射性，受半衰期影響 非放射性標(biāo)記 生物素、地高辛、熒光素 等； 敏感性較弱,生物素-親合素系統(tǒng) (biotin-avidin system，BAS),生物素 biotin 小分子生長(zhǎng)因子，可偶聯(lián)多種標(biāo)記物； 親和素 avidin，鏈霉親合素 streptavidin 生物素的天然特異性結(jié)合物 可結(jié)合4個(gè)生物素分子,生物素 Biotin,多層次信號(hào)放大系統(tǒng),生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn),靈敏度高 特異性強(qiáng) 穩(wěn)定性好 適用性廣 經(jīng)濟(jì)性,地高辛標(biāo)記技術(shù),地高辛(Digoxigenin, DIG) 又稱(chēng)異羥基洋地黃毒甙元，來(lái)自毛地黃屬植物花

22、與葉 是一種類(lèi)固醇半抗原分子，可與地高辛抗體特異結(jié)合,地高辛標(biāo)記與檢測(cè),人工將地高辛與dUTP 連接形成DIG-11-dUTP，并摻入到合成探針或寡核苷酸末端 探針與目標(biāo)DNA雜交后，用連接有堿性磷酸酶或其它偶聯(lián)物的地高辛的抗體檢測(cè)地高辛標(biāo)記探針 根據(jù)抗體偶合物不同，通過(guò)熒光檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光或底物顯色等可顯示探針雜交的位置,熒光標(biāo)記技術(shù),通過(guò)能發(fā)射熒光的物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來(lái)提供被研究對(duì)象的信息。,熒光標(biāo)記物,吸收某一波長(zhǎng)的光波后能發(fā)射出波長(zhǎng)更長(zhǎng)光子（能量更低）的物質(zhì) 小分子熒光染料 大多含有苯環(huán)/雜環(huán)并帶有共軛雙鍵 如異硫氰酸熒光素（FITC）、羥

23、基熒光素（FAM）、羅丹明類(lèi)、菁染料等 熒光蛋白 GFP，藻紅蛋白 等,熒光標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn),操作簡(jiǎn)便 高穩(wěn)定性 高靈敏度 高選擇性 波長(zhǎng)覆蓋范圍廣 保持生物學(xué)活性和免疫活性，安全無(wú)毒,FISH中的常用熒光素,FISH 探針的要求,特異性 用超純水洗滌1min; 再固定脫水：乙醇脫水 50% 80% 96%; 為增加細(xì)菌膜對(duì)探針的通透性，用無(wú)色肽酶achromopeptidase處理 為防止內(nèi)源過(guò)氧化物酶的干擾，用0.15% H2O2(溶于甲醇中)于室溫下處理30min,然后用96%乙醇脫水,預(yù)雜交 雜交液(含2%封閉液)覆蓋； 濕盒中，35 ，23h； 加50ml的37 預(yù)熱的洗滌液保溫30min

24、； 室溫下，用含0.05%Triton-X-100的PBS漂洗15min； 雜交 雜交液：1PBS，0.1%封閉液，0.0015% H2O2 ，1/500熒光標(biāo)記探針 37 ，30min, 漂洗,室溫下，用含0.05%Triton-X-100的PBS漂洗15min； 冰浴的超純水, 封片 封片前需對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞進(jìn)行區(qū)域區(qū)分，如：利用DAPI（4,6-diamidino-2-phenylindole）染色界定細(xì)菌的區(qū)域等。 鏡檢 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡 OLYMPUS DP11數(shù)字顯微照相機(jī),蘭色部分為DAPI染色結(jié)果;綠色和紅色熒光為探針雜交結(jié)果，標(biāo)簽為5m,左圖：用PLA886-H

25、RP雜交的Pirellula sp. SL 中圖：海底淤泥用ARCH915(綠色)和DSS658(紅色)雜交結(jié)果 右圖：海底淤泥用EelMS932(綠色)和DSS658(紅色)雜交結(jié)果,FISH技術(shù)與放射性標(biāo)記比較,放射性標(biāo)記： 探針不穩(wěn)定、空間定位不準(zhǔn)確、同位素操作繁瑣 優(yōu)點(diǎn) 試劑探針經(jīng)濟(jì)、安全 探針?lè)€(wěn)定（2 years） 實(shí)驗(yàn)周期短、特異性好、定位準(zhǔn)確 靈敏度較高 多重?zé)晒鈽?biāo)記技術(shù)的發(fā)展可完成多重檢測(cè) 缺點(diǎn) 雜交效率受到探針長(zhǎng)度和細(xì)胞通透性等影響,FISH技術(shù)小結(jié),優(yōu)點(diǎn) 探針?lè)€(wěn)定、操作安全； 可快速顯示多個(gè)不同探針的雜交信號(hào),在一次雜交中可檢測(cè)多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關(guān)系；

26、局限 檢測(cè)易受到各種污染的干擾，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性； 依賴(lài)于通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)的探針, 難以探測(cè)到新菌種； 菌群只能鑒定到門(mén)、類(lèi)的分類(lèi)級(jí)別，僅作為輔助手段；,共附生微生物及其代謝產(chǎn)物的研究,可培養(yǎng)海綿細(xì)菌的分離 可培養(yǎng)海綿放線菌的分離 海魚(yú)體內(nèi)共生菌的分離培養(yǎng) EPA的發(fā)酵,可培養(yǎng)海綿細(xì)菌的分離,材料：采集海綿后，用聚乙烯袋封好，迅速送回實(shí)驗(yàn)室 培養(yǎng)基：ZoBell 2216E培養(yǎng)基 無(wú)菌操作：用無(wú)菌刀片切除外周部分，中間部分切成小塊，置于滅菌后的陳海水中，20 搖床（200rpm）培養(yǎng)3-5d。 梯度稀釋?zhuān)簾o(wú)菌陳海水稀釋 分離方法：稀釋混合平板法 培養(yǎng)條件：20 ，5-8d,可培養(yǎng)海綿放線

27、菌的分離,材料：采集海綿后，用聚乙烯袋封好，迅速送回實(shí)驗(yàn)室 培養(yǎng)基：放線菌1號(hào)培養(yǎng)基； 放線菌2號(hào)培養(yǎng) 無(wú)菌操作：用無(wú)菌刀片切除外周部分，中間部分切成1mm3的小塊，置于滅菌后的陳海水中，20 搖床(200rpm)培養(yǎng)3-5d。 梯度稀釋?zhuān)簾o(wú)菌陳海水稀釋 分離方法：稀釋混合平板法 培養(yǎng)條件：20 ，5-8d 思考：培養(yǎng)基中添加抑霉菌素(150 g/mL)和鏈霉素(30 g/mL)用途？,海魚(yú)體內(nèi)共生菌的分離培養(yǎng),培養(yǎng)基： ZoBell 2216E培養(yǎng)基 無(wú)菌操作：表面消毒 分離方法：稀釋混合平板法 培養(yǎng)條件：25 ，35d 菌種純化：劃線法 菌種鑒定：16S rRNA,EPA的發(fā)酵,EPA(e

28、icosa pentaenoic acid，二十碳五烯酸) 抗凝血，可預(yù)防和治療血栓、動(dòng)脈硬化等疾病，并具有降血脂的功效。 早期的EPA來(lái)自于海洋魚(yú)類(lèi) Wirsen等證明：別單胞菌屬(Alteromonas)的一種嗜壓嗜冷菌可產(chǎn)生EPA，且EPA的含量隨壓力的增加和溫度的降低而逐漸升高。,Yazawa等對(duì)從海水中分離到的5000余株細(xì)菌進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)其中88株G-菌可產(chǎn)生EPA，從中鑒別出一種工程菌SCRC-8132，在分類(lèi)上接近腐敗互生單胞菌 Alteromonas putrefaciens。 Uematsn等對(duì)從海洋魚(yú)類(lèi)的腸道中分離到的20000余株細(xì)菌進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)500余株可產(chǎn)生EPA，含量最高可達(dá)300400mg/L培養(yǎng)物，EPA可達(dá)總脂肪酸的2440%。,EPA發(fā)酵生產(chǎn)工藝,培養(yǎng)基：PYMG培養(yǎng)基(蛋白胨1%、酵母浸出液0.5%、血浸汁0.25%、葡萄糖2%、1/2人工