1、Engineered Saccharomyces cerevisiae that produces 1,3-propanediol from D-glucose 工程化啤酒酵母細(xì)胞利用D-葡萄糖生產(chǎn)1,3-丙二醇 文獻(xiàn)查找：張帆 文獻(xiàn)翻譯：曾熙、朱悅、張帆 PPT整理及展示：張艷麗（組長）,二、背景,三、實(shí)驗(yàn)方法,一、摘要,四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果,摘要,在發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中啤酒酵母是一種安全的微生物。1,3-丙二醇是一種廣泛用于聚合物生產(chǎn)的重要化學(xué)原料，但是由于化學(xué)合成成本昂貴，它的實(shí)用性受到限制。本研究的目的就是利用工程化啤酒酵母低成本生產(chǎn)1,3-丙二醇。 啤酒酵母利用D-葡萄糖作為原料，能夠生產(chǎn)丙三醇，而不

2、是1.3-丙二醇。在本研究中，我們克隆了兩個基因yqhD和dahB，這兩個基因可以使丙三醇轉(zhuǎn)化成1,3-丙二醇，把這兩個基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)整合到啤酒酵母的W303-1A染色體上。這個工程化的啤酒酵母通過功能性yqhD和dhaB基因來實(shí)現(xiàn)D-葡萄糖到1,3-丙二醇的生產(chǎn)。 據(jù)了解，該研究在1,3-丙二醇生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)中是一種安全的、低成本的方法。,背景,背景,使用與成 本的矛盾,降低成本,化學(xué)合成 發(fā)酵,背景,克雷伯肺炎菌：在克雷伯肺炎菌中，參與1,3-丙二醇的生物合成的基因是dhaB和dhaT。DhaB是一種依賴維生素B12的脫水酶，它轉(zhuǎn)化丙三醇到3-羥基丙醛，而DhaT是一種依賴NADH的氧化

3、還原酶，它可以轉(zhuǎn)化3-羥基丙醛到1,3-丙二醇。 大腸桿菌：大腸桿菌能利用D-葡萄糖生產(chǎn)丙三醇，可以通過把dhaB和dhaT基因整合到大腸桿菌來生產(chǎn)1,3-丙二醇，但是DhaT活性過低，導(dǎo)致收率低。yqhD基因的發(fā)現(xiàn)解決了這一問題。,背景,克雷伯肺炎菌的生產(chǎn)原料是丙三醇，價格昂貴。 大腸桿菌產(chǎn)生內(nèi)毒素，可能引起疾病。 啤酒酵母已經(jīng)用于發(fā)酵產(chǎn)業(yè)好多年了，主要是由于它使用D-葡萄糖這種低成本原料作為碳源和能源。 野生型啤酒酵母只產(chǎn)生丙三醇，但沒有產(chǎn)生1,3-丙二醇的能力。,背景,實(shí)驗(yàn)方法,一、材料：PCR試劑、限制酶、小牛堿性磷酸酶、凝膠提取盒、尼龍膜等,二、培養(yǎng)基和生長條件,實(shí)驗(yàn)方法,四種培養(yǎng)基

4、： 發(fā)酵條件：有氧環(huán)境、搖床250rev/min30。,LB培養(yǎng)基,YPD培養(yǎng)基,B培養(yǎng)基,CM培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)方法,用于這項(xiàng)研究的菌株、質(zhì)粒和引物：,實(shí)驗(yàn)方法,DNA片段的PCR擴(kuò)增 分別構(gòu)建包含yqhD基因的pZR1質(zhì)粒和dahB基因的pZR2質(zhì)粒 分別構(gòu)建包含yqhD基因的pZR1質(zhì)粒和dahB基因的pZR2質(zhì)粒 土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 啤酒酵母染色體上的yqhD和dhaB基因的PCR與印跡雜交分析 氣相色譜法測定1,3-丙二醇,實(shí)驗(yàn)方法,分別構(gòu)建包含yqhD基因的pZR1質(zhì)粒和dahB基因的pZR2質(zhì)粒；構(gòu)建pZR3質(zhì)粒；構(gòu)建包含yqhD和dhaB基因的質(zhì)粒pZR4,實(shí)驗(yàn)方法,土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)

5、的轉(zhuǎn)化 在本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將yqhD基因和dhaB基因整合到啤酒酵母的染色體上。 第一步，質(zhì)粒pZR4通過電穿孔轉(zhuǎn)染到農(nóng)桿菌LBA4404，形成LBA4404-ZR4.農(nóng)桿菌LBA4404-ZR4在含有博來霉素的B培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，收菌，在B培養(yǎng)基上重懸培養(yǎng)（含或不含100umol/l乙酰丁香酮），生長到1x1011cell ml-1，再孵化培養(yǎng)6h。 與此同時，啤酒酵母W303-1在搖床30下培養(yǎng)過夜，稀釋20倍到新鮮的YPD培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6h。細(xì)胞通過離心收集，用不含乙酰丁香酮的B培養(yǎng)基清洗，然后重懸，接種到相同培養(yǎng)基上，最后生長到1x109cells ml-1. 隨后，50

6、ul啤酒酵母W303-1A和50ul農(nóng)桿菌LBA4404-ZR4做好前期混合準(zhǔn)備，儲存在高壓蒸汽過的膠膜紙上（直徑25mm），上面有固體CM培養(yǎng)基，添加乙酰丁香酮，孵育在28，72h。然后，膠膜紙被移到固體YPD培養(yǎng)基（含150ug/ml博來霉素），孵育30，3-4days。為了預(yù)防供體農(nóng)桿菌過生長，在培養(yǎng)基中添加了200ug/ml頭孢噻肟。啤酒酵母指定的W303-1A-ZR，在30，YEPD（含150ug/ml博來霉素）培養(yǎng)基中進(jìn)一步純化。,實(shí)驗(yàn)方法,啤酒酵母染色體上的yqhD和dhaB基因的PCR與印跡雜交分析：,實(shí)驗(yàn)方法,酶試驗(yàn) 細(xì)胞粗提物通過細(xì)胞糊狀物聲波破碎和離心獲得，細(xì)胞粗提物含各

7、種酶。 丙三醇脫水酶活性通過使用3-甲基-2-苯并噻唑方法評估。 由于3-羥基丙醛的不穩(wěn)定性，1,3-丙二醇氧化還原同工酶活性通過逆反應(yīng)（1,3-丙二醇轉(zhuǎn)化到3-羥基丙醛）來斷定。 1,3-丙二醇同工酶的濃度通過Gerlind方法斷定。 所有酶試驗(yàn)在30度中進(jìn)行。 一個酶活單位定義成：30度下，催化1umol底物到產(chǎn)物所需的酶數(shù)量。特殊的酶活力顯示的單位/mg蛋白。所有酶試驗(yàn)重復(fù)兩次，報道的數(shù)值是兩次實(shí)驗(yàn)的均值。細(xì)胞提取物中的蛋白濃度是通過Bradford法斷定的。,實(shí)驗(yàn)方法,氣相色譜法測定1,3-丙二醇： 1,3-丙二醇和丙三醇是通過氣相色譜法測定的。本研究使用的圓柱體是2m X 5mm不銹鋼圓柱體，包裝的色譜載體是101.氮?dú)?，流?0 ml min-1.檢測溫度定在220，圓柱體溫度定在210。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,工程化啤酒酵母關(guān)鍵質(zhì)粒的構(gòu)建 基因yqhD和dhaB整合到啤酒酵母的染色體 工程化啤酒酵母W303-1A-ZR能夠利用D-葡萄糖生產(chǎn)1,3-丙二醇,實(shí)驗(yàn)