1、生物制品概述,細胞工程,一、生物制品的定義,生物制品：是應(yīng)用普通的或以基因工程、細胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細胞及各種動物和人源的組織和液體等生物材料制備、用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。,一、生物制品的定義,我國人用生物制品包括以下五類： 疫苗 抗毒素及免疫血清 血液制品 細胞因子 體內(nèi)及體外診斷制品及其他活性制劑（包括毒素、抗原、變態(tài)反應(yīng)原、單克隆抗體、重組DNA產(chǎn)品、抗原-抗體復(fù)合物、免疫調(diào)節(jié)劑、微生態(tài)制劑等）。,二、生物制品的分類,2.1 疫苗（Vaccines） 細菌類疫苗（Bacterial Vaccines）：也稱菌苗，由細菌、螺旋體或其衍生物制成，

2、如卡介苗、傷寒Vi多糖疫苗、破傷風(fēng)疫苗（類毒素）等。 病毒類疫苗（Viral Vaccines） ：由病毒、衣原體、立克次體或其衍生物制成，如麻疹減毒活疫苗、重組（CHO細胞）乙型肝炎疫苗等。 聯(lián)合疫苗（Combined Vaccines）：由二種或二種以上疫苗抗原配制成的具有多種免疫原性的滅活疫苗或活疫苗，如百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗（DTP），麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹聯(lián)合疫苗（MMR）等。,二、生物制品的分類,2.2 抗毒素及免疫血清（Antitoxin and Antisera） 由特定抗原免疫動物所得血漿制成的抗毒素或免疫血清，如破傷風(fēng)抗毒素、抗狂犬病血清等，用于治療或被動免疫預(yù)防。

3、,二、生物制品的分類,2.3 血液制品（Blood Products） 由健康人的血漿或特異免疫人血漿分離、提純或由重組DNA技術(shù)制成的血漿蛋白組分或血細胞組分制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子（天然或重組的）、紅細胞濃縮物等，用于診斷、治療或被動免疫預(yù)防。,二、生物制品的分類,2.4 細胞因子（Cytokines） 由健康人血細胞增殖、分離、提純或由重組DNA技術(shù)制成的多肽類或蛋白質(zhì)類制劑，如干擾素（IFN）、白細胞介素（IL）、集落刺激因子（CSF）、紅細胞生成素（EPO）等，用于治療。,二、生物制品的分類,2.5 診斷制品（Diagnostic Reagents） 體外診斷制品

4、：由特定抗原、抗體或有關(guān)生物物質(zhì)制成的免疫診斷試劑或診斷試劑盒，如傷寒、副傷寒、變形桿菌（OX19、0X2、OXK）診斷菌液，沙門氏菌屬診斷血清，HBsAg酶聯(lián)免疫診斷試劑盒等。 體內(nèi)診斷制品：由變態(tài)反應(yīng)原或有關(guān)抗原材料制成的免疫診斷試劑，如卡介菌純蛋白衍生物（BCG-PPD）、布氏菌純蛋白衍生物（RB-PPD）、錫克試驗毒素、單克隆抗體等。,二、生物制品的分類,26其他制品（Else Products） 由有關(guān)生物材料或特定方法制成、不屬于上述5類的其他生物制劑，用于治療或預(yù)防疾病。如治療用A型肉毒毒素制劑、微生態(tài)制劑和卡介菌多糖、核酸制劑等。,三、生物制品的命名,命名原則：參照中國生物制品

5、傳統(tǒng)命名及WHO規(guī)程命名方式，制品的基本名稱一般可由三個部分組成。 （制法或群、型別）（病名、微生物名、組分、人名或材料）（品種名即制品種類） 例：重組（酵母）乙型肝炎疫苗,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),1、疫苗的種類 已有的疫苗概括起來分為活疫苗、滅活疫苗、代謝產(chǎn)物和亞單位疫苗以及生物技術(shù)疫苗，其中生物技術(shù)疫苗又分基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、抗獨特型疫苗，基因工程活疫苗以及DNA疫苗等。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),（1）活疫苗 簡稱活苗，有強毒苗、弱毒苗和異源苗三種。 強毒苗是應(yīng)用最早的疫苗種類，使用強毒進行免疫有較大的危險，非情況特殊不予使用。 弱毒苗是目前使用的最廣泛的疫苗，弱毒苗的毒力已致

6、弱，仍保持原有抗原性，并能在體內(nèi)繁殖，用較少劑量誘導(dǎo)產(chǎn)生堅實的免疫力。有些弱毒苗可刺激產(chǎn)生干擾素，可抵抗其他野毒的感染。 弱毒苗有的可能散毒，而且保存期較短，將其制成凍干苗可延長保存期。 異源苗是用具有共同保護性抗原的不同種微生物制備成的疫苗。如用鴿痘病毒預(yù)防雞痘等。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),（2）滅活疫苗：病原微生物經(jīng)理化方法滅活后，仍然保持免疫原性，接種后使動物產(chǎn)生特異性抵抗力，這種疫苗稱為滅活疫苗（死苗）。 缺點：死苗接種后不能在動物體內(nèi)繁殖，因此使用接種劑量較大，免疫期較短，需加入適當(dāng)?shù)淖魟┮栽鰪娒庖咝Ч娱L免疫期。 優(yōu)點：研制周期短、使用安全和易于保存。目前所使用的有組織滅活苗、油佐

7、劑滅活苗和氫氧化鋁膠滅活苗等。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),佐劑: 一種物質(zhì)先于抗原或與抗原混合同時注入動物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮輔助作用，這類物質(zhì)統(tǒng)稱為佐劑或免疫佐劑。 加入佐劑減少抗原用量和接種次數(shù)。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),佐劑的類型 不溶性鋁鹽類佐劑 應(yīng)用很廣泛，通常使用的主要有氫氧化鋁膠、明礬、磷酸三鈣等。 油水乳劑佐劑 是用礦物油、乳化劑(如Span-80、Tween-80)及穩(wěn)定劑(硬脂酸鋁)，按一定比例混合作為油相，然后與抗原液混合制成各種類型的油水乳劑。 蜂膠佐劑 合成佐劑 胞壁酰二肽(MDP)及其衍生物等。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),（3）

8、代謝產(chǎn)物和亞單位疫苗 代謝產(chǎn)物疫苗：如毒素、酶等都可制成疫苗，破傷風(fēng)毒素、白喉毒素、肉毒毒素、致病性大腸桿菌腸毒素，經(jīng)甲醛滅活后制成的類毒素有好的免疫原性，可作為主動免疫制劑。 亞單位疫苗：是將病毒的衣殼蛋白與核酸分開、除去核酸用提純的蛋白質(zhì)衣殼制成的疫苗。此類苗保含有病毒的抗原成分，無核酸，因而無不良反應(yīng)，使用安全，效果較好。豬口蹄疫、偽狂犬病、狂犬病等亞單位疫苗已有成功的試驗報道。亞單位疫苗由于制備困難，價格昂貴。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),（4）生物技術(shù)疫苗 利用生物技術(shù)制備的分子水平的疫苗，包括基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、抗獨特型疫苗、基因工程活疫苗以及DNA疫苗。 基因工程亞單位疫

9、苗 ：用DNA重組技術(shù)，將編碼病原微生物保護性抗原的基因?qū)耸荏w菌(如大腸桿菌)或細胞，使其在受體細胞中高效表達，分泌保護性抗原肽鏈。提取保護性抗原肽鏈，加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),（4）生物技術(shù)疫苗 DNA疫苗: 是一種最新的分子水平的生物技術(shù)疫苗，將編碼保護性抗原的基因與能在真核細胞中表達的載體DNA重組，重組的DNA可直接注射(接種)到動物(如小鼠)體內(nèi)，目的基因可在動物體內(nèi)表達，刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),2、病毒與細胞培養(yǎng) 病毒的培養(yǎng)繁殖只能在活細胞內(nèi)進行，是以病毒基因為模板，在酶的作用下，分別合成其基因及蛋白質(zhì)，再組裝成

10、完整的病毒顆粒，這種方式稱為復(fù)制。 常見的病毒培養(yǎng)方法有：細胞（包括組織器官）培養(yǎng)法；雞胚培養(yǎng)法；實驗動物培養(yǎng)法。 SPF動物或SPF雞胚，仍常用于培養(yǎng)病毒，但病毒細胞培養(yǎng)發(fā)展最快，重點介紹。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),2.1、病毒細胞培養(yǎng) 概念：將適宜組織中的細胞分散，在培養(yǎng)液中進行細胞培養(yǎng)，再接種病毒，讓病毒在細胞中繁殖來培養(yǎng)病毒的方法。 用途：用于病毒學(xué)研究，分離病毒，病毒克隆純化，病毒病診斷及疫苗制備等。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),細胞培養(yǎng)類型：原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、細胞株 細胞培養(yǎng)的方法：最常用的方法為靜置培養(yǎng)及旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，還可用懸浮培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)技術(shù)等。 靜置培養(yǎng)：將消化分散的細胞懸液分

11、裝于培養(yǎng)瓶(管)或培養(yǎng)板(孔)，生成貼壁的單層細胞。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：細胞可在培養(yǎng)瓶(管)的四壁長滿單層，此法的產(chǎn)量高，適用于疫苗生產(chǎn)。微載體培養(yǎng)也用于規(guī)?；毎蛞呙缟a(chǎn)。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),2.2 病毒與細胞相互作用的類型 宿主細胞感染病毒發(fā)生的變化有殺細胞和非殺細胞兩種。 具體分為細胞死亡（殺細胞、細胞病變、細胞裂解），生產(chǎn)性（細胞存活、允許病毒繁殖、分泌釋放），非生產(chǎn)性（細胞存活、阻斷病毒復(fù)制），轉(zhuǎn)化（病毒基因與細胞基因整合、可致腫瘤、細胞形態(tài)變化）。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),2.2 病毒與細胞相互作用的類型 病毒引致的殺細胞變化：感染導(dǎo)致的細胞損傷稱之為細胞病變(CPE)。CPE可在光

12、學(xué)顯微鏡下觀察，是病毒學(xué)檢測及研究的常規(guī)手段之一。 病毒產(chǎn)生CPE的能力與其對動物的致病力正相關(guān)，因此通常用CPE作為指標，來判定病毒的毒力，即計算病毒的半數(shù)細胞感染量(TcID50)。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),2.2 病毒與細胞相互作用的類型 空斑或蝕斑：將10倍梯度稀釋的病毒樣本接種吸附于單層細胞，而后在細胞上覆蓋一層含營養(yǎng)液的瓊脂，以防止游離的病毒通過營養(yǎng)液擴散，但病毒可在細胞間傳遞。經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，進行染色，原先感染病毒的細胞及病毒擴散的周圍細胞會形成一個近似圓形的斑點，類似固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),2.2 病毒與細胞相互作用的類型 將獲得的單個空斑制作懸液，

13、梯度稀釋后再作空斑，最終可獲得只含一個病毒顆粒及其子代的空斑，這就是病毒克隆。借助空斑技術(shù)不僅可純化病毒，還對病毒定量，定量單位稱為空斑形成單位(PFU)。 通過PFU的計數(shù)及PFU減數(shù)試驗，可滴定血清的效價、測定干擾素的活性等。許多動物病毒如皰疹病毒、披膜病、微RNA病毒及水泡性口炎病毒均可通過此法作定量分析。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),2.2 病毒與細胞相互作用的類型 病毒引致的非殺細胞變化：非殺細胞病毒的感染通常引致持續(xù)感染，對細胞的新陳代謝并無大礙，但同時還生產(chǎn)并釋放子代病毒顆粒。除少數(shù)例外，大多持續(xù)感染的細胞發(fā)生慢性漸進性變化，最終死亡。,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),3、疫苗制備工藝流程 例：流行性乙型腦炎病毒死疫苗制備工藝 地 鼠 腎剪碎，胰酶消化 地鼠腎細胞懸液 37,3天 細胞培養(yǎng)液，pH7.0pH7.2 單層細胞 洗滌細胞，去除牛血清 10-410-5濃度病毒感染細胞 3234培養(yǎng)23天 收獲病毒液（收二次） 按1:2000加入甲醛， 22，8天滅活病毒液 合并，安全及效力試驗（原液 ） 加入亞硫酸氨鈉（半成品） 分裝（成品） 檢定(包括理化性質(zhì)，無菌試驗、安全試驗，防腐劑、殘余牛血清含量等） 合格成品,細胞培養(yǎng),病毒感染,病毒滅活,四、疫苗及疫苗制備技術(shù),病毒滅活：病毒受理化因素作用后，失去感染性。 滅活