1、1.2 基因工程的基本操作程序,專題1 基因工程,（1）目的基因的獲取,（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建,（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定,基因工程基本操作程序主要包括四個(gè)步驟：,一、目的基因的獲取,（一）目的基因：,主要是_的基因,編碼蛋白質(zhì),如：與生物抗逆性相關(guān)的基因 與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因 與生物藥物和保健品相關(guān)的基因 與毒物降解相關(guān)的基因 與工業(yè)所需酶相關(guān)的基因,也可是具有調(diào)控作用的因子（如增強(qiáng)子等）,（二）目的基因的獲取方法：,1、從基因文庫中獲取,（1）基因文庫：,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為

2、基因文庫。,（2） 基因文庫的種類：,部分基因文庫,基因組文庫,基因組文庫：,包含了一種生物的所有基因，其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。,部分基因文庫：,包含了一種生物的部分基因， 如cDNA文庫。,提取某種生物的全部DNA,用適當(dāng)?shù)?限制酶切,一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,基因組文庫,基因組文庫的構(gòu)建方法：,cDNA文庫的構(gòu)建方法-反轉(zhuǎn)錄法,某種生物的單鏈mRNA,合成互補(bǔ)DNA,形成雙鏈DNA（即cDNA）,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,與載體連接,cDNA文庫,逆轉(zhuǎn)錄酶 （反轉(zhuǎn)錄酶）,DNA聚合酶,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),

3、編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū): 能編碼蛋白質(zhì)的序列 非編碼區(qū): 不能能編碼蛋白質(zhì)的序列（含基因表達(dá)的調(diào)控序列）,知識(shí)補(bǔ)充：,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,內(nèi)含子：,外顯子：,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（啟動(dòng)子）。,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,基因組文庫和cDNA文庫比較：,（3）從基因文庫中得到目的基因的方法：,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。 如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能

4、 基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,（1）PCR技術(shù)：,是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。,（2）原理：,DNA雙鏈復(fù)制,（3）條件：,DNA模板 引物（一對(duì)） 4種脫氧核苷酸 Taq酶（耐高溫的DNA聚合酶） 緩沖液,（4）過程：,變性、退火、延伸三步曲, 變性：,雙鏈DNA單鏈DNA,55 60, 退火：,90 95,引物與單鏈DNA模板結(jié)合(堿基互補(bǔ)配對(duì)), 延伸：,70 75,Taq酶的作用下，從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸,（5）結(jié)果：,每循環(huán)一次，目的基因可增加一倍， 呈指數(shù)

5、形式（2n）擴(kuò)增。,PCR擴(kuò)增儀,PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,4種脫氧核苷酸,模板、能量、DNA聚合酶,DNA在高溫變性 解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細(xì)胞內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個(gè)DNA分子,3、人工合成法,如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心,1、構(gòu)建表達(dá)載體的目的：, 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以 遺傳給下一代； 使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)成及作用：,復(fù)制原點(diǎn),目的基因,啟動(dòng)子,終止子,標(biāo)記基因,啟

6、動(dòng)子：,位于基因首端的一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位； 作用：驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,終止子：,位于基因尾端的一段有特殊結(jié)構(gòu)DNA片斷。 作用：使轉(zhuǎn)錄終止,標(biāo)記基因：,為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來（如抗生素抗性基因）。,注意： 啟動(dòng)子與終止子不同于起始密碼和終止密碼 啟動(dòng)子與終止子位于DNA上，是DNA片段，與基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。 起始密碼和終止密碼位于mRNA上， 是3個(gè)相鄰的堿基，與翻譯（蛋白質(zhì)的合成）有關(guān)。,克隆載體與表達(dá)載體的構(gòu)成： 二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片 段。表達(dá)載體在克隆載體基礎(chǔ)上增加了啟動(dòng) 子、終止

7、子，啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因 表達(dá)必不可少。,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,1、轉(zhuǎn)化：,目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。,2、常用的轉(zhuǎn)化方法：,（1）導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法：, 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）,a. 農(nóng)桿菌：,土壤中的一種微生物，自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。,b.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理：,植物受傷時(shí)，傷口處細(xì)胞會(huì)分泌大量酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上,c. 過程：,優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、有效, 基因槍法,單子葉植物常用的方法

8、，成本較高。, 花粉管通道法,簡便經(jīng)濟(jì) （我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉）,（2）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法：, 常用方法：,顯微注射法, 常用的受體細(xì)胞：,受精卵,目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物, 流程：,（3）導(dǎo)入微生物細(xì)胞的方法：, 原核生物特點(diǎn)：,繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少, 方法：,用Ca2+（或CaCl2溶液）處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化。,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,1、轉(zhuǎn)基因生物DNA上是否插入了目的基因,（1）方法：,DNA分子雜交技術(shù),（2）過程：,. 提取轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA . 用放射性同位標(biāo)

9、記的目的基因的DNA片段 做探針，與轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交， 若顯示出雜交帶，表明目的基因已插入染 色體DNA中。,2、目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA,（1）方法：,分子雜交技術(shù),（2）過程：,. 提取轉(zhuǎn)基因生物的mRNA . 用放射性同位標(biāo)記的目的基因的DNA片段 做探針，與轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交， 若顯示出雜交帶，表明目的基因轉(zhuǎn)錄出 mRNA。,3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),（1）方法：,抗原抗體雜交,（2）原理：,抗原與抗體的特異性結(jié)合,（3）過程：,. 提取轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì) . 用針對(duì)目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)（抗原）的 抗體（放射性標(biāo)記），與轉(zhuǎn)基因生物的蛋 白質(zhì)（抗原）雜交，若顯示出雜

10、交帶，表 明目的基因已形成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。,除了上述分子水平的鑒定，有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定：,比如做抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)， 以確定是否有抗性以及抗性的程度； 或?qū)蚬こ坍a(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較，以確定功能是否相同,【特別提示】 關(guān)注“操作程序”中的四個(gè)易混點(diǎn) (1)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的。目的基因 應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位。 (2)目的基因與載體相連接時(shí)，可能出現(xiàn)3種連接 方式，如目的基因目的基因、目的基因 載體、載體載體。為了防止目的基因或載 體自連，基因工程中常用2種不同的限制酶對(duì) 目的基因和載體進(jìn)行切割，并保證目的基因 的定向連接（啟動(dòng)子在其前，終止子在其 后，保證