1、江 紅 三所五室,核酸研究的基本技術(shù),1. 核酸的分離、純化和鑒定: 基因組DNA、質(zhì)粒、總RNA 2. PCR技術(shù): 反應(yīng)體系、常見的PCR技術(shù)、 PCR產(chǎn)物的克隆、表達、鑒定 3. 核酸分子的雜交: Southern-blot Northern-blot 4. 新基因的克隆和功能研究,Tm值(DNA的熔點或解鏈溫度),概念：指加熱變性使 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失 去一半時的溫度。,一、核酸的分離、純化和鑒定 基因組DNA的分離、純化：PCR、 Southern- blot、構(gòu)建基因組文庫 實驗材料：哺乳動物組織(50100mg) 哺乳動物細胞(5x106107),實驗步驟：RT 勻漿：TE p

2、H8.0 組織( 液氮凍存、研磨) 消化：EDTA 、SDS、蛋白酶K、RNase 37/55 抽提：酚、氯仿、異戊醇 沉淀：異丙醇 / NaAc+無水乙醇 洗滌：75乙醇 干燥：風(fēng)干 溶解：TE / H2O,注意事項： 1. 試劑：pH值準確 2. 蛋白酶K：20mg/ml， 分裝，-20，避免反復(fù)凍融 3. 抽提：完全，不要觸及蛋白層 4. 干燥：避免過分 5. 操作：小心，機械剪切作用，80100kb,2. 總RNA的分離純化: RT-PCR、Northern-blot 實驗材料：哺乳動物組織(50100mg) 哺乳動物細胞(5x106107),實驗步驟： 勻漿：Trizol 組織( 液

3、氮凍存、研磨) 抽提：氯仿 沉淀：異丙醇 / NaAc + 無水乙醇 RT 15min 洗滌：75乙醇 干燥：風(fēng)干 溶解：DEPC-H2O 保存：分裝，-70，避免反復(fù)凍融,注意事項： (1) 無RNase環(huán)境：手套勤換、試劑專用、DEPC處理 玻璃器皿：180C干烤8小時以上 塑料器皿：氯仿沖洗 0.1%DEPC水溶液浸泡(RT 12h或37C 2h)，高壓 滅菌去除DEPC,(1) 核酸的定量：,OD260：DNA, RNA; OD280：蛋白質(zhì) 濃度： 1OD260： 50g/ml ds DNA 40g/ml ss DNA，總RNA 35g/ml 單鏈RNA 20g/ml 單鏈寡核苷酸

4、核酸純度: OD260 / OD280 DNA 1.8 RNA 1.72.1 2.0 OD260和OD280應(yīng)大于0.05，,(2) 核酸的凝膠電泳：分離、純化 瓊脂糖凝膠電泳：agarose, 水平, TAE, EB(2ng), 紫外燈,遷移率：同樣大小的分子 超螺旋 線性分子 缺口或松弛,DNA Marker: DL2000, DNA/Hind,聚丙烯酰胺凝膠電泳: PAGE(Acr+Bis)， 垂直，銀鹽染色 非變性，變性,4. 質(zhì)粒： 概念：細菌等微生物細胞染色體以外，能獨立進行 復(fù)制和遺傳，賦予宿主細胞一定生物學(xué)性狀 的共價閉環(huán)雙鏈DNA分子。,載體：指可容忍外源DNA片段插入、可在

5、細胞間轉(zhuǎn)移 并能在細胞內(nèi)自主復(fù)制的DNA分子。 如:細菌質(zhì)粒、噬菌體和某些病毒,組成：復(fù)制子、啟動子、多克隆位點、選擇標記基因,復(fù)制子：ColE1, pMB1, pSC101，控制著質(zhì)粒在細菌中的拷貝數(shù)。 啟動子：位于表達載體，啟動基因的轉(zhuǎn)錄，如Ptac, PCMV, PSV40等。 多克隆位點(MCS)：人工合成的含多個單一限制性內(nèi)切酶識別位點 的一段特殊的DNA序列，便于酶切、插入重組 和克隆DNA分子。 選擇標記基因：Ampr、Tetr、Kanr、Neor,分類,按用途分類 克隆載體 表達載體：含有強啟動子，使克隆化的外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量 的mRNA。依其發(fā)揮作用的宿主細胞不同，分為 原

6、核、真核、酵母、昆蟲、病毒表達載體。,按復(fù)制能力分類 嚴謹性質(zhì)粒：它們的復(fù)制伴隨著染色體復(fù)制，1幾個拷貝。 松弛型質(zhì)粒：它們的復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)，10200拷貝，常用。,穿梭質(zhì)粒：人工構(gòu)建 兩種不同復(fù)制起點和選擇標記 兩種不同的宿主細胞中存活和復(fù)制 轉(zhuǎn)移基因 基因表達活性和功能,分離：堿裂解法、煮沸法：劇烈，小質(zhì)粒 去污劑(SDS)裂解法：易受損的大質(zhì)粒 (15kb),堿裂解法,收菌 重懸：TE-葡萄糖 裂解：變性，NaOH-SDS 5min 中和：復(fù)性，KAc 抽提：酚:氯仿:異戊醇(25:24:1) 沉淀：異丙醇 洗滌：70乙醇 溶解：TE-RNase A,純化：氯化銫-溴化乙錠梯度平衡

7、離心 聚乙二醇分級沉淀法,Kit: 堿裂解，DNA介質(zhì)(硅膠、玻璃奶),互補現(xiàn)象,pUC系列質(zhì)粒 (lac操縱子),-半乳糖苷酶氨基端,細菌 (-半乳糖苷酶N-末端缺陷型),藍色菌落,外源DNA插入,白色菌落,-半乳糖苷酶,缺陷型,藍白篩選,1.原理 2.反應(yīng)體系 3.類型 4.PCR產(chǎn)物的克隆、表達和鑒定,二、PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù),1985, Mullis K, PCR，Klenow 1988, Saiki, Taq 酶,1、原理: 模板變性、引物退火、DNA pol進行DNA合成,PCR產(chǎn)物呈指數(shù)方式增加 2530個循環(huán) 理論109 實際105107,2、PCR反應(yīng)體系：25100

8、 l,1)模板DNA：單鏈或雙鏈DNA, 避免DNA聚合酶抑制劑和能 結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)污染, 10.1g。,2)引物：人工合成的兩段與待擴增靶DNA側(cè)翼片段互補的寡核苷酸。 20pmol,3)Mg2+的濃度：反應(yīng)產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量，1.5mmol/L。,4)dNTP：50200mol/L，四種dNTP濃度相同。,5)Taq DNA聚合酶：Klenow, Taq酶, 高保真Taq酶, 2.5U/100l 。,6)參數(shù)：94 5min - 30(94 30sec - 55 30sec - 721 min) - 72 7min,1)長度一般為1825個堿基； 2)盡可能選擇堿基隨機分布的序列； 3

9、)兩條引物的G+C的百分比應(yīng)盡量相似，多為4555%； 4)避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)； 5)兩引物之間不應(yīng)發(fā)生互補，特別是在3端; 6)引物3末端堿基可以影響Taq酶的延伸效率，最好 選T、G或C，而非A； 7)引物5端允許有一段序列不與模板配對, 內(nèi)切酶，保護堿基。,引物設(shè)計原則,退火溫度計算公式： 1) T=2(A+T)+4(G+C)-35 2) T=22+1.46 ln35 ln=2(G or C)+(A or T) 2035nt 3) T=81.5+16.6lgJ+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%) J+=monovalent cations l=oligonuc

10、leotide length FA=formamide 1470nt,Taq酶合成延伸速率：22 0.25nt/sec， 37 1.5nt/sec， 55 24nt/sec， 70 60nt/sec 1.Taq酶單克隆抗體: 低溫與Taq酶結(jié)合，抑制活性; 高溫與Taq酶解離，釋放活性。 2.模板變性后加入Taq酶。,熱啟動PCR: 提高特異性,3、影響因素,模板：ng級的質(zhì)粒DNA，g級基因組DNA。 引物：引物濃度不宜偏高，否則易形成引物二聚體。 Mg2+濃度：特異性及產(chǎn)量 dNTPs濃度：正確性和產(chǎn)量 Taq酶用量：非特異性 循環(huán)參數(shù)：常規(guī)為2530個循環(huán),對照：陽性對照 陰性對照：不加

11、模板,4、特點：特異性、有效性、忠實性,操作簡便省時； 靈敏度高； 特異性較強，但有一定的假陽性率。提高退火溫度可以提高特異性； 對原始材料的質(zhì)量要求較低； 有一定程度的單核苷酸錯誤摻入。因為Taq DNA聚和酶缺乏35核酸外切酶活性，不能糾正反應(yīng)中發(fā)生的錯誤核苷酸摻入。,1)反轉(zhuǎn)錄PCR：RT-PCR,5、常見類型,PCR,關(guān)鍵：總RNA完整性 反轉(zhuǎn)錄引物,隨機引物,特異下游引物,第一輪PCR,第二輪PCR,2)巢式PCR: 模板數(shù)低,3) RACE: cDNA末端的快速克隆,AAAAA,m7Gppp,5,3,5RACE,3RACE,3RACE,5RACE,方法一：Cap-Finder,方法

12、二 GeneRacer,連接頭,cDNA第一鏈,5末端,3末端,1.第一鏈的合成至關(guān)重要 1) 確定所需的mRNA的存在 2) mRNA中存在的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)可能對反轉(zhuǎn)錄有影響， 采用熱穩(wěn)定的具反轉(zhuǎn)錄活性的DNA聚合酶 2.反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后通過兩次NH4Ac沉淀去除多余dNTP和引物 3.內(nèi)源性同聚序列的影響 1)降低引物的用量 0.5pmol/g mRNA/20l反應(yīng)體積 2)避免太低的雜交溫度,注意,4)長片段PCR,Taq酶：LA Taq酶 5U/ 50l反應(yīng) dNTP: 2.5mM 8 l 延伸：5min 循環(huán)：25,6)差異PCR,5)DNA指紋分析：隨機引物,遺傳學(xué)圖譜繪制、系統(tǒng)生物學(xué)、

13、發(fā)育生物學(xué),1)大量擴增目的核酸片段 2)克隆新基因 3)生物多態(tài)性的研究 4)核酸測序 5)在核酸中引入突變 6)檢測基因的整合、表達情況 7)疾病的診斷,6、PCR在生物學(xué)中的應(yīng)用,1.需突變位點位于基因兩側(cè)，只需在合成引物時，直接加上突變堿基即可； 2、當突變位于基因的中間部位時，可以采用以下兩種方法進行突變,在基因中引入突變,方法一,方法二,DNA的序列測定：Sanger雙脫氧鏈終止法測序的原理,單鏈模板DNA,測序引物,5,3,4種dNTP(包括 32PdNTP) DNA聚合酶,ddTTP,ddCTP,ddGTP,ddATP,造成鏈末端終止的雙脫氧核苷酸,新合成的DNA,1)陰陽性對

14、照 2)配制PCR混合物 PCR buffer+dNTP+H2O 3)控制污染: 靶序列污染，氣溶膠 紫外線照射 更換實驗場所、設(shè)備、試劑 暫停實驗,7、注意事項,8、限制性核酸內(nèi)切酶,核酸酶：是一類能切割相鄰的兩個核苷酸殘基之間的磷酸二 酯鍵，使核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解的蛋白酶。 基因工程中最常用的核酸酶是核酸內(nèi)切酶。 限制性核酸內(nèi)切酶: 簡稱限制酶，是一類能識別雙鏈DNA分子 中特異核苷酸序列的DNA水解酶，它能特 異地結(jié)合于限制酶識別序列或其附近的位 點，并在此切割雙鏈DNA分子。,概念,分類,I類: 識別部位復(fù)雜，特異性差，在識別序列周圍400 7000bp范圍內(nèi)切割DNA。 II類

15、：能識別雙鏈DNA的特定序列并進行切割，產(chǎn)生特異 的DNA片段，常規(guī)應(yīng)用于分子克隆中。 III類：在識別位點周圍2727bp范圍內(nèi)切割DNA。,命名原則,EcoR I,第一個大寫字母：屬的縮寫 兩個小寫字母：種的縮寫 第二個大寫字母：不同變種和品系的縮寫 羅馬數(shù)字： 同一微生物中多種限制酶分離的順序,特征,識別序列：46個核苷酸，迴文結(jié)構(gòu)。 切割產(chǎn)物：同時切割dsDNA的兩條鏈 平滑末端或粘性末端,酶活性單位,一個活性單位：在適當?shù)姆磻?yīng)條件，1小時， 完全酶解1g DNA底物， 限制性內(nèi)切酶的量。,單酶切/雙酶切反應(yīng)：30 l,37 4h,標準的酶解反應(yīng)：50l反應(yīng)體系，1U內(nèi)切酶， 最適反應(yīng)

16、條件， 1小時， 1g DNA完全降解。,影響活性因素,DNA：純度、甲基化程度、分子結(jié)構(gòu) 緩沖液：pH值 溶液：離子種類及濃度 消化反應(yīng)的溫度 反應(yīng)體系中甘油濃度,指改變酶反應(yīng)條件時，酶原有的識別特異性降低的現(xiàn)象，即限制酶在非標準反應(yīng)條件下，能切割一些與其特異識別序列相似的序列。一般在相應(yīng)限制酶的名稱右上角加一個星號(*)表示。 幾乎所有的限制酶都具有。,星號活力：Star活力,星號活力的誘發(fā)因素,甘油含量高：酶量不超過反應(yīng)體積的10%； 1/30 內(nèi)切酶用量過大：100U/gDNA； 210U/g DNA 離子強度低：25mmol/L； 推薦Buffer pH值高：pH7.58.5, Ec

17、oRI出現(xiàn)*；pH7.0 含有機溶劑：DMSO，乙酸等; DNA純度 二價陽離子：Mn+, Co+, Zn+等； Mg+,9、PCR產(chǎn)物的克隆、表達和鑒定,PCR產(chǎn)物,A-T克隆,測序,重組表達載體,重 組 蛋 白,制備抗體,檢測活性,轉(zhuǎn) 染 細 胞,1)查找目的基因序列：mRNA序列 NCBI GenBank,1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 45 1 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15 46 ccc ttc tgc cct cct ttg ctg gcg aca gcc

18、tct caa atg cag atg 90 16 P F C P P L L A T A S Q M Q M 30 541 gac gta gaa gca gct ctg acc aaa gcc ctt ggg gaa gtg gac att 585 181 D V E A A L T K A L G E V D I 195 586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621 196 L L T W M Q K F Y K L *,2)酶切位點分析,/web_apps/web_map

19、/start,3)設(shè)計引物,選擇載體,原核表達載體：His: pET, pRSET GST: pGEX 酵母載體：YCP 真核表達載體：pcDNA3, pcDNA3.1 myc: pCMV-myc, pcDNAmyc/His HA: pcMV-HA Flag GFP: pEGGFP-N, pEGFP-C, pIRES2-EGFP RFP 昆蟲表達載體： 病毒表達載體：pAdEasy,His-tag,GST-tag,5 保護堿基+酶切位點+起始密碼+目的基因序列 3,1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 45 1 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15,上游引物,上游有標簽 讀框,586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621 196 L L T W M Q K F Y K L *,下游引物: