1、名校名 推薦第 43 講微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用 考綱要求 1. 微生物的分離和培養(yǎng)。2. 某種微生物數(shù)量的測定。3. 培養(yǎng)基對微生物的選擇作用。考點一微生物的實驗室培養(yǎng)1 培養(yǎng)基的分析(1)據(jù)物理狀態(tài)的不同，培養(yǎng)基只有液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩種類型()(2)培養(yǎng) 基中一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽四種成分()(3)在配制培養(yǎng)基時，除滿足營養(yǎng)需求外，還應(yīng)考慮ph、 o2 及特殊營養(yǎng)物質(zhì)的需求()2 無菌技術(shù) ( 連一連 )3 純化大腸桿菌(1) 制備固體培養(yǎng)基的流程計算 稱量 溶化 滅菌 倒平板(2) 純化大腸桿菌的方法常用的微生物接種方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法。平板劃線法： 是通過接種環(huán)在

2、瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。稀釋涂布平板法： 是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。易錯警示(1) 自養(yǎng)微生物與異養(yǎng)微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)不同：自養(yǎng)微生物所需的碳源、氮源來自含碳、含氮的無機物，而異養(yǎng)微生物需要的碳源、氮源來自含碳、含氮的有機物， 因此可根據(jù)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)判斷微生物的代謝類型。含氮無機物不但能給自養(yǎng)微生物提供氮源，也能作為能源物質(zhì)，提供能量，如nh3 既作為硝化細(xì)菌的氮源也作為能源。 (2) 配制牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的注意事項：倒平板的適宜溫度是 50 左右， 溫度過高會燙手

3、， 過低培養(yǎng)基又會凝固。平板需倒置，這樣既可使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。(3) 平板劃線操作1名校名 推薦的注意事項： 第一次劃線及每次劃線之前都需要灼燒接種環(huán)。灼燒接種環(huán)， 待其冷卻后才能伸入菌液， 以免溫度太高殺死菌種。 劃線時最后一區(qū)不要與第一區(qū)相連。 劃線用力大小要適當(dāng)，防止用力過大將培養(yǎng)基劃破。1 下列無菌操作中，錯誤的是()a無菌操作的目的是防止雜菌污染b用酒精擦拭雙手的方法對操作者進行消毒c實驗操作過程應(yīng)在酒精燈火焰附近進行d玻璃器皿 ( 吸管、培養(yǎng)皿 ) 可用酒精擦拭答案d解析對操作者應(yīng)用較溫和的方法進行消毒。實驗操作過程應(yīng)在酒精燈火

4、焰附近進行，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。對無菌操作用到的玻璃器皿要用干熱滅菌的方法徹底消滅其中的微生物，用酒精擦拭不能達到目的。2 下列是用于從土壤中分離純化土壤細(xì)菌的培養(yǎng)基配方。請回答：試劑牛肉膏蛋白胨nacl瓊脂水用量5 g10 g5 g20 g1 000 ml(1) 培養(yǎng)基的類型有很多，但培養(yǎng)基中一般都含有水、碳源、_和無機鹽。上述培養(yǎng)基配方中能充當(dāng)碳源的成分是_ 。培養(yǎng)基配制完成以后，一般還要調(diào)節(jié)ph，并對培養(yǎng)基進行_ 處理。該培養(yǎng)基從物理性質(zhì)上分類屬于 _ 。(2) 分離純化微生物最常使用的接種方法是_ 和 _。(3) 假設(shè)培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上菌落連成一片，可能的原因是什么？(

5、列舉兩項 )_ _ 。答案(1)氮源 牛肉膏和蛋白胨滅菌固體培養(yǎng)基(2) 平板劃線法稀釋涂布平板法(3)稀釋倍數(shù)不夠，菌液的濃度太高；劃線時，劃完第一次沒有滅菌即接著劃第二次；培養(yǎng)過程中滅菌不嚴(yán)格，受到了其他微生物的污染( 任選兩個 )解析培養(yǎng)基中都應(yīng)含有水、無機鹽、碳源和氮源。配制培養(yǎng)基時加入了瓊脂，因此該培養(yǎng)基屬于固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制完成后要調(diào)ph 和滅菌。牛肉膏、蛋白胨中含碳元素，可作為有機碳源。 分離純化微生物一般用平板劃線法和稀釋涂布平板法。平板劃線法中每次劃線前都要將接種環(huán)灼燒滅菌，以殺死上次劃線時接種環(huán)上殘留的菌種；采用稀釋涂布平板法時稀釋度要足夠高，否則會使微生物不能分散成單

6、個細(xì)胞。1 微生物和動植物營養(yǎng)要素的比較項目碳源氮源能源無機鹽、水動物糖類、脂肪等蛋白質(zhì)或其降同碳都需要， 種類2名校名 推薦糖類、脂肪、醇、有異養(yǎng)型機酸等微生物自養(yǎng)型co2、碳酸鹽等綠色植物2 消毒和滅菌比較解物源及功能基本蛋白質(zhì)或其降同碳相同解物、銨鹽、源硝酸鹽、 n 等2氧化無機3nh、銨鹽、硝物或酸鹽等利用光能銨鹽、硝酸鹽光能比較項目理化因素的消滅微生芽孢和孢子作用強度物的數(shù)量能否被消滅消毒較為溫和部分生活狀不能態(tài)的微生物滅菌強烈全部微生物能3. 兩種純化細(xì)菌的方法的比較項目優(yōu)點缺點平板劃可以觀察菌落特征， 對混合菌進行分離不能計數(shù)線法稀釋涂可以計數(shù)，可以觀察菌落特征吸收量較小， 較麻

7、煩，平板不干燥效果布平板法不好，容易蔓延4 培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成(1) 各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽。(2) 不同 培養(yǎng)基要滿足不同微生物對ph、特殊營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的需求?？键c二 分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)1 完善土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)(1) 分離原理：土壤中細(xì)菌之所以能分解尿素，是由于它們體內(nèi)能合成脲酶，這種物質(zhì)在把尿素分解成無機物的過程中起到催化作用。(2) 統(tǒng)計菌落數(shù)目：統(tǒng)計樣品中的活菌一般用稀釋涂布平板法。(3) 實驗流程：土壤取樣樣品的稀釋微生物的培養(yǎng)與觀察細(xì)菌的計數(shù)。2 判斷正誤(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素()(2)篩選分解尿素的細(xì)

8、菌應(yīng)以尿素作為培養(yǎng)基中的唯一氮源()(3)統(tǒng)計樣品中的活菌一般用平板劃線法()(4) 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變藍，則說明篩選到分解尿素的細(xì)菌()3名校名 推薦易錯警示(1) 在同一稀釋度下，至少對3 個平板進行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。如果某個平板的菌落數(shù)與其他差別甚遠(yuǎn)，說明該平板操作過程中出現(xiàn)失誤，應(yīng)舍棄。(2) 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。這是因為當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。3 自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時一

9、般要將它們分離提純，然后進行數(shù)量的測定。下面是對大腸桿菌進行數(shù)量測定的實驗，請回答有關(guān)問題。實驗步驟：(1) 制備稀釋倍數(shù)為 102、 103、 104、 105、 106 的系列稀釋液。(2) 為了得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，你選用_法接種樣品。(3) 適宜溫度下培養(yǎng)。結(jié)果分析：(1) 測定大腸桿菌數(shù)時，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106 的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確可信的是_ ，其理由是 _ 。a一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230b兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是 220 和 260，取平均值240c三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、 50 和 520，取平均值260d四個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、 3

10、00、 240 和 250，取平均值250(2) 一同學(xué)在稀釋倍數(shù)為105 的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均值為234，那么每毫升樣品中的菌落數(shù)是_( 涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1 ml) 。(3) 用這種方法測定的大腸桿菌密度，實際活菌數(shù)量要比測得的數(shù)量_，因為 _ 。答案 實驗步驟： (2) 稀釋涂布平板結(jié)果分析： (1)d在設(shè)計實驗時， 一定要涂布至少三個平板作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力與準(zhǔn)確性；在分析實驗結(jié)果時，要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否合理(2)2.34 10 8(3) 多當(dāng)兩個或多個細(xì)菌連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落解析實驗步驟：為了得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，應(yīng)用稀

11、釋涂布平板法接種樣品。結(jié)果分析： (1) 選取多個菌落數(shù)相差不大的平板計數(shù)，取其平均值。(2)234 0.1 10 52.34 10 8。(3) 因為菌落可能由兩個或多個細(xì)菌連在一起生長而成，所以實際活菌數(shù)量要比測得的數(shù)量多。1 篩選菌株的原理微生物的選擇培養(yǎng)：在選擇培養(yǎng)基的配方中，把尿素作為培養(yǎng)基中的唯一氮源，原則上4名校名 推薦只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。2 統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法(1) 顯微鏡直接計數(shù)法原理： 利用特定細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物數(shù)量。方法：用計數(shù)板計算。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌。(2) 間接計數(shù)法 ( 活菌計數(shù)法 )原理： 當(dāng)樣品的

12、稀釋度足夠高時， 培養(yǎng)基表面生長的一個菌落， 來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。操作： a. 設(shè)置重復(fù)組，增強實驗的說服力與準(zhǔn)確性。b為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在 30 300 的平板進行計數(shù)。計算公式：每克樣品中的菌株數(shù) (cv)m，其中 c 代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，v 代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml) ， m代表稀釋倍數(shù)。3 鑒定分解尿素的細(xì)菌2 22 脲酶233ph升高，(1) 原理： co(nh)h oco 2nh；由于 nh的產(chǎn)生，培養(yǎng)基堿性增強，因此可通過檢測ph 的變化來判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。(

13、2) 方法：以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌，若指示劑變紅，則 ph 升高，說明該種細(xì)菌能分解尿素。4 對照原則的運用(1) 判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染，需將未接種的培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng)。(2) 判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用，需設(shè)立牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行接種后培養(yǎng)，觀察兩種培養(yǎng)基上菌落數(shù)目，進行對比得出結(jié)論。考點三分解纖維素的微生物的分離1 纖維素酶(1) 組成：一種復(fù)合酶，它至少包括三種組分，即c1 酶、 cx 酶和葡萄糖苷酶。c1酶葡萄糖(2) 作用：纖維素 纖維二糖 葡萄糖cx酶苷酶2 篩選方法(1) 方法：剛果紅染色法，即通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。(2

14、) 培養(yǎng)基：以纖維素為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基。3 篩選流程土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。易錯警示對選擇培養(yǎng)基的選擇方法區(qū)分不清(1) 在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。例如，加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可以得到金黃色葡萄球菌。 這里的加入是在主要營養(yǎng)成分完整的基礎(chǔ)上加入。5名校名 推薦(2) 改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。例如缺乏氮源時可以分離出固氮微生物；石油作為唯一碳源時，可以分離出能消除石油污染的微生物。(3) 改變微生物的培養(yǎng)條件。例如，將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境下培養(yǎng)，可以得到耐高溫的微生物。4 纖維素分解菌能夠產(chǎn)生纖維素酶分解

15、纖維素?；卮鹣铝袉栴}：(1) 在篩選纖維素分解菌的過程中，通常用_ 染色法，這種方法能夠通過顏色反應(yīng)直接對纖維素分解菌進行篩選。甲同學(xué)在實驗時得到了如圖所示的結(jié)果，則纖維素分解菌位于()abcd(2) 乙同學(xué)打算從牛胃中分離纖維素分解菌并計數(shù)，與分離醋酸菌相比，進行培養(yǎng)時除了營養(yǎng)不同外，最主要的實驗條件差別是_ 。該同學(xué)采用活菌計數(shù)法統(tǒng)計的菌落數(shù)目往往比活菌的實際數(shù)目_。(3) 丙同學(xué)在提取和分離纖維素酶的過程中，為了抵制外界酸和堿對酶活性的影響，采取的措施是向提取液和分離液中添加 _ 。若探究纖維素酶活性的最適溫度，如何設(shè)置對照？ _ 。答案 (1) 剛果紅 a (2) 保證無氧環(huán)境小 (

16、低 )(3) 緩沖溶液不同的溫度梯度之間相互對照解析 (1) 剛果紅與纖維素形成的紅色復(fù)合物在纖維素被分解后將不再形成，則在培養(yǎng)基上出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。(2) 牛胃是一個厭氧的環(huán)境，所以其中的纖維素分解菌與需氧的醋酸菌培養(yǎng)條件有所不同。因是活菌計數(shù)法，所以部分死亡菌無法計數(shù)。另外當(dāng)兩個或多個細(xì)菌連在一起時平板上只觀察到一個菌落，所以偏小。(3)探究最適溫度可設(shè)置一系列的溫度梯度相互對照，其他無關(guān)變量要適宜。1 兩種菌株篩選原理的比較土壤中分解尿素的細(xì)菌分解纖維素的微生物選擇培養(yǎng)基的成分：纖維素作為唯一的碳選擇培養(yǎng)基的成分：尿素作為唯一的氮源源鑒定方法：在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，鑒定方法：剛果紅染色法，即剛果紅與纖若指示劑變紅，ph 升高，說明細(xì)菌能分解尿維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被分解后，素培養(yǎng)基出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈2 選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基的比較種類制備方法原理用途舉例6名校名 推薦依據(jù)某些微生物從眾多微生物中加入青霉素分離培養(yǎng)基中加入某對某些物質(zhì)或環(huán)選擇培養(yǎng)基分離所需的微生得到酵母菌和霉些化學(xué)物質(zhì)境條件的嗜好、物菌抗性而設(shè)計依據(jù)微生物產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物培養(yǎng)基中加入某與培養(yǎng)基中的特伊紅美藍培養(yǎng)基