1、常用免疫學(xué)相關(guān)實驗技術(shù)及方法,第一節(jié) 免疫學(xué)方法概論,一、免疫學(xué)方法的發(fā)展史 1976年：Jenner發(fā)明了接種牛痘方法預(yù)防天花 2個世紀(jì)后被廣泛接受，1979年（WHO）天花滅跡。 19世紀(jì)末期：koch病原體是感染性疾病病因 促進了實驗免疫學(xué)的發(fā)展。,19世紀(jì)80年代：Pasteur預(yù)防雞霍亂的疫苗 狂犬病疫苗 1888：Behring發(fā)現(xiàn)了抗體 Methchnikoff發(fā)現(xiàn)了巨噬細胞 20世紀(jì)初：發(fā)現(xiàn)了調(diào)理素，體液因素可影響吞噬細胞功能 1900-1930：認識了過敏反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了血清病 Arthus反應(yīng)，皮膚反應(yīng) 調(diào)理作用，補體結(jié)合反應(yīng) 疫苗研究有了新發(fā)展：BCG結(jié)核 白喉毒素白喉,19

2、35-1957：抗體純化，鑒定及測定技術(shù)、 凝膠內(nèi)沉淀技術(shù)，抗原抗體、 免疫電泳等血清血技術(shù) 1959-1974：放射標(biāo)記免疫技術(shù)、酶標(biāo)免疫技術(shù)、 生物素-親和素標(biāo)記免疫技術(shù)、 熒光標(biāo)記免疫技術(shù)、金(銀)標(biāo)記免疫等技術(shù)； 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、免疫分子轉(zhuǎn)染技術(shù)、 細胞和細胞因子測定技術(shù),20世紀(jì)70年代后期：免疫及分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展成熟， 單克隆抗體問世，組織相容性抗原、 B細胞免疫球蛋白基因重組，T細胞受體 1980：PCR技術(shù) 生物芯片技術(shù) 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù),免疫學(xué)方法就是通過實驗證實機體免疫反應(yīng)的過程。 基本參與單位有：抗原 抗體 免疫細胞和免疫分子,第二節(jié) 體液免疫學(xué)方法,一、抗原制備 1.

3、 天然抗原制備 (1)粗抗原的提?。簝鋈诜?、冷熱交替法、超聲法(1-2HE) (2)粗抗原純化： 選擇性沉淀法：鹽析沉淀法、核酸沉淀法 凝膠過濾和離子交換層析 親和層析法 蛋白電泳,2. 合成抗原制備 化學(xué)合成高分子氨基酸聚合物，即多肽。 合成肽與載體蛋白連接后能有效誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生免疫應(yīng)答 常用方法：tea bag method 純化方法：反向高效液相色譜法,二、抗體制備 1. 多克隆抗體制備(polyclonal antibody) 多克隆抗體是指在自然免疫或免疫動物后產(chǎn)生的具有不同特異性和親和性的多種抗體混合分子。具有抗多種不同抗原的表位。,2. 單克隆抗體制備(monoclonal ant

4、ibody) 單克隆抗體是指由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。 產(chǎn)生方法：B細胞克隆與小鼠骨髓瘤細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細胞,3. 基因工程抗體 (engineer antibody) 應(yīng)用抗體庫技術(shù)產(chǎn)生 方法：將某種動物所有抗體的可變區(qū)基因克隆到質(zhì)粒或噬菌體中并表達，然后利用不同抗原篩選出攜帶特異抗體的基因克隆，從而獲得特異性抗體。,三、抗體的應(yīng)用及其相應(yīng)的免疫學(xué)技術(shù) (一)ELISA ELISA的基本原理是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，使之成為酶標(biāo)抗體(或抗原)。這種酶標(biāo)抗體或抗原既保留其免疫原性，又保留酶的活性；中外，使抗原或抗體固定到某種固相載體表面并保持其免疫活性，利用抗原、抗體

5、復(fù)合物的免疫學(xué)反就原理來測定未記標(biāo)的抗原(或抗體)。具體操作時是把受檢標(biāo)本(檢測其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原蔌抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，經(jīng)洗滌后使固相載體上形成的抗原、抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合到固相載體上的酶量與標(biāo)本中的受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，其量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺來進行定性或定量分析。,(二)放射免疫測定(radioimmunoassay) 放射免疫測定通常用于測定組織液和血液中的激素水平。放射免疫分析多數(shù)用125I來標(biāo)記抗體。被檢測抗原即未標(biāo)記物，通常吸附在固相載體中，如多孔

6、酶聯(lián)塑料板或試管中。在此固相載體中標(biāo)記的特異性抗體與特定的未標(biāo)記抗原產(chǎn)生特異性免疫結(jié)合。非特異性吸附可以通過加入過量的非特異性卵磷脂蛋白或洗滌液來封閉。未結(jié)合的標(biāo)記抗體則用洗液去除。最終特異性結(jié)合的抗原、抗體復(fù)合物殘留在反應(yīng)板或試管中。用125I標(biāo)記的抗體，其放射性強度可以直接測定。,(三)免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technology) 免疫熒光技術(shù)的原理是將熒光色素與特異性抗體(或抗原，但少用)以化學(xué)的方式結(jié)合起來，但不影響該血清抗體的免疫特性。而后將熒光標(biāo)記了的抗體作為一個試劑，在特定的條件下浸染標(biāo)本，使之與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。這個反應(yīng)的結(jié)果含有熒光標(biāo)

7、記的抗原、抗體結(jié)合物，可用熒光顯微鏡來觀察之。,(四)免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunolhistochemistry) 檢測組織切片中蛋白分子在細胞中分布的另一種方法(類似于免疫熒光技術(shù))為免疫組織化學(xué)技術(shù)。該方法是用化學(xué)的方法將酶與抗體結(jié)合起來(類似于ELISA)，然后將標(biāo)記的抗體與組織切片中的抗原產(chǎn)生特異性的結(jié)合。結(jié)合后的抗原、抗體復(fù)合物中含有的酶可將再加入的無色酶底物通過化學(xué)反應(yīng)呈色，最終借助顯微鏡在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)及其分析。,(五)免疫印跡技術(shù)(immunoblot) 免疫印跡技術(shù)也稱Western blot或蛋白印跡技術(shù)(protein blot)，是20世紀(jì)70年代末

8、80年代初發(fā)展起來的一種蛋白質(zhì)抗原檢測新技術(shù)。其基本過程是將蛋白質(zhì)樣品(如血清或細胞組織碎片)在凝膠電泳中分離，再通過電轉(zhuǎn)染將已分離的蛋白南分子轉(zhuǎn)移到固相膜上，然后在固相膜上用標(biāo)記(放射標(biāo)記或酶標(biāo)記)的特異性抗體檢測蛋白質(zhì)抗原煤。免疫印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辯力高和固相免疫測定敏感、簡便、穩(wěn)定等優(yōu)點。,(六)免疫電泳技術(shù) 免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點，是一加快了沒淀反應(yīng)的速度，二是將一些蛋白質(zhì)組分利用其電荷的不同將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以其沉淀線的最高抗體稀釋度為該抗體的效價。 1. 免疫電泳 2. 對流免疫電泳 3. 火箭免疫電泳 4. 免疫固定電泳 5

9、. 聚丙烯酰胺凝膠電泳,第三節(jié) 細胞免疫學(xué)技術(shù),一、白細胞的分離 血液中紅細胞與白細胞比例為600:11000:1，兩者的比重不同，其沉降速度亦異，通常用兩種方法加以分離。 1. 自然沉降法 2. 聚合物加速沉降法,二、外周血單個核細胞的分離 外周血單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞密度較大，為1.09左右，而淋巴細胞和單核細胞密度為1.075-1.090，血小板為1.030-1.035。為此利用一種密度介于1.075-1.092之間而近于等滲透的溶液(分層液)做密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。常用

10、的分Ficoll和Percoll兩種。,三、淋巴細胞及其亞群的分離 純淋巴細胞的采集 黏附貼壁法 磁鐵吸引法,四、淋巴細胞亞群的分離 E花環(huán)沉降法 尼龍毛分離法 親和板結(jié)合分離法 熒光激活細胞分離儀分離法 流式細胞分選法,五、淋巴細胞的功能分析 (一)T細胞功能的檢測 T細胞轉(zhuǎn)化試驗 (1)非抗原性刺激物 (2)抗原性刺激物,2. 細胞殺傷試驗 (1)形態(tài)學(xué)檢查法 (2)放射性核素法,(二)B細胞功能的檢測 B細胞早期活性指標(biāo)的測定 溶血空斑形成試驗 B細胞增殖能力的試驗,(三)NK細胞能力的檢測 形態(tài)法 酶釋法 熒光法 放射性 化學(xué)發(fā)光法,(四)吞噬細胞的檢測 中性粒細胞功能的檢測 (1)細

11、胞運動功能檢測 (2)吞噬和殺菌功能的檢測 2. 巨噬細胞功能的檢測 (1)炭粒廓清試驗 (2)吞噬功能的檢測 (3)巨噬細胞溶酶體酶的測定,第二十二章,常用分子生物學(xué)相關(guān)實驗技術(shù)及方法,第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng),一、PCR技術(shù)原理 PCR是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法，其特異性是由兩個人工合成的引物序列決定的。在DNA聚合酶催化的一系列合成反應(yīng)中，用兩段寡核苷酸作為反應(yīng)的引物。一般情況下，這兩段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分別與模板進行加熱變性。隨之將反應(yīng)混合特冷卻至某一溫度，使引物與它的靶序列進行配對，稱為退火。嗣后，退火引物可在DNA聚合酶作用下進行延伸。上述過程是由溫度控制

12、的。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)。PCR是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。,(一)高溫變性 基因組模板DNA加熱至90-95度，可使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈成為單鏈。 (二)低溫退火 將反應(yīng)混合物降溫，使引物與單鏈DNA模板(或從mRNA反轉(zhuǎn)錄而來的cDNA)上的互補序列得性，形成模板-引物復(fù)合物谷稱退火，是DNA復(fù)制的固定起點。 (三)中溫延伸 在DNA的合成過程中，鏈的延伸溫度在60-72度。,二、PCR分類 經(jīng)典PCR 反轉(zhuǎn)錄PCR 免疫PCR,第二節(jié) 生物芯片技術(shù),生物芯片是指在面積不同的基片（玻璃、硅片、尼龍膜、金屬、凝膠等）表面上有序地點陣排列了一系列識另分子(cD

13、NA、DNA、肽、蛋白質(zhì)或寡核苷酶等)，固定在每一點陣上的分子都是可尋址的；然后在相同條件下，點陣上的分子與其“配體”分子反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果用核素、熒光、化學(xué)發(fā)光或酶標(biāo)法顯示，通過計算機軟件分析，綜合在可讀的IC總信息。,第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因動物,一、轉(zhuǎn)基因動物的概念及發(fā)展史 轉(zhuǎn)基因動物(transgeni animal)是指所有細胞基因組中穩(wěn)定地整合由人工導(dǎo)入的外源基因，能正常表達并能遺傳給后代的一類動物。僅有部分組織細胞的基因組中整合有外源基因的動物，稱為嵌合體動物(chimera animal)。,二、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù) 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的基本原理：將經(jīng)過基因工程改造過的目的基因（或基因組片段，或人工染色體），用不同的基因轉(zhuǎn)移方法導(dǎo)入供體動物的受精卵（或早期胚胎細胞），然后